2018 Fiscal Year Research-status Report
Developmental change in synaptic plasticity of corticomotoneuronal direct connections: Do motoneurons learn?
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18K06528
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| Research Institution | Teikyo University |
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Principal Investigator |
大野 孝恵 帝京大学, 医学部, 准教授 (60508109)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福田 諭 帝京大学, 医学部, 助教 (50425641)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 運動ニューロン / シナプス可塑性 / ホールセル記録 / 皮質脊髄路 / 急性スライス / 長期増強LTP |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1) 逆行性に標識した前腕筋支配運動ニューロン (MN)より継時的にホールセル記録を行い、大脳皮質運動野から脊髄MNへの直接シナプスが形成され除去される過程を正確にとらえる。
具体的には、皮質脊髄路(CST)-MN結合における単シナプス性の興奮性シナプス後電流 (EPSC)の陽性率を、生後6日齢(P6)からP50にかけて継時的に記録した（独自の頸随スライス作製法は技術的にも安定し、成体まで確実にdataを取得することが可能である）。その結果、P6からP8にかけて結合頻度は増加し、P8からP13まで60%前後でプラトー相を成し、P14からP20にかけて漸減してP20以降はほぼ消失していることを確認し得た。これは、我々が既に論文中で報告しているウイルスを用いた逆行性標識にて区間推定した一過性の皮質運動ニューロン直接結合時期と合致した結果であった。さらに、P22からP50ではCST-MN-EPSCは記録できないのに対し、感覚性入力(Ia)-MN-EPSCやCST-介在ニューロン(IN)-EPSCは100%記録可能であり、CSTならびにMN自体の損傷はないことを示唆する。
2) 皮質脊髄路シナプス除去に伴って見られるシナプス応答の変化をとらえる。
具体的には、1)の結果を踏まえて、皮質脊髄路シナプスの形成過程と思われるP6-P8と除去過程に相当するP14-P20に分けて、シナプス可塑性の変化を観察比較した。preliminaryな結果ではあるが、P8-P9では長期抑圧(LTD)は見られず長期増強(LTP)のみ出現、一方シナプス除去の開始に先立つP13からP14ではLTPが減弱しLTDが出現しており、シナプス除去過程における活動依存的メカニズムの関与が示唆される。また、この結果は、長年に渡りブラックボックスであった脊髄MN自体のシナプス可塑性の有無を明らかにする一歩となり得るものと考える。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
科研費申請時の平成３０年度の達成目標として、1) 前腕筋支配運動ニューロンよりホールセル記録を行い、皮質脊髄路軸索からのシナプスが形成される日齢と除去される日齢を正確にとらえる、2) 皮質脊髄路シナプス除去に伴って見られるシナプス応答の変化をとらえる（具体的にはシナプス可塑性の変化として、シナプス除去に先行するLTPの減少・消失もしくはLTDの出現を観察記録し、LTP, LTDの発現前後でpaired pulse ratioに変化が見られるか否かでその変化がシナプス前終末(pre)によるものなのか, シナプス後膜(post)によるものなのかを同定する）の２項目をあげている。
1)に関しては、皮質脊髄路-運動ニューロンシナプスにおける単シナプス性のEPSC陽性率を生後6日齢 (P6)からP50にかけて経時的に記録し比較するという本研究の主軸となる実験を完了し、平成３０年度日本神経科学学会にてポスター発表、2019年北米神経科学学会にてポスター発表予定（登録済み）、現在英語論文に投稿中である。
2)に関しても、脊髄運動ニューロンにおけるLTPおよびLTDそれぞれの誘発に有効な反復刺激の強度を決定し、実際に注目している日齢におけるLTPならびにLTDの出現に成功している。現在データの蓄積中であり、今後活動依存的シナプス除去のメカニズム解明に貢献出来るものと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の計画としては、申請書類の平成31年度計画通り以下の順に研究を進めて行く。
1) 前腕筋支配運動ニューロン以外の脊髄運動ニューロン（手内筋, 上腕筋, 胸筋, および傍脊柱筋支配運動ニューロン）への皮質からの直接結合の有無を確認した上で、高等霊長類で見られるような支配筋による入力頻度の差が齧歯類においても存在するのか否かを観察する。入力頻度は、平成30年度の研究と同様に単シナプス性CST-MN-EPSCの陽性率で評価する。
2) Grin 2B-floxマウスの前腕筋支配運動ニューロンにChAT-CREを発現させる事により、運動ニューロン特異的に2Bをノックアウトし、2Bの消失により運動ニューロンからのシナプス除去が阻害されるか否かを明らかにする。(具体的には、野生型でシナプス除去がほぼ完了するP22以降での結合頻度を確認し、シナプス除去過程に対する活動依存的修飾の有無を検討する)
3) Sema6Dノックアウトマウスを用いて、Sema6Dの消失により運動ニューロンからのシナプス除去が阻害されるか否かを明らかにする。(具体的には、2)と同様にP22以降での結合頻度を確認し、本系におけるシナプス除去過程に対する遺伝的要素の関与の度合いを検討する)
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| Causes of Carryover |
本課題を継続するにあたり、2019年度以降に使用予定の実験動物ならびに各種試薬の等消耗品、研究の発表ならびに研究内容に関する討論の場としての国内および海外学会への参加費、更には、次の段階で必要な機器の購入のため、次年度使用額は必須なものである。
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