2018 Fiscal Year Research-status Report
Effects of multiple binding sites of CYP2C9 on its allosteric modulation
| Project/Area Number |
18K06613
|
|---|
| Research Institution | Doshisha Women's College of Liberal Arts |
|---|
Principal Investigator |
前川 京子 同志社女子大学, 薬学部, 教授 (70270626)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安達 基泰 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所 東海量子ビーム応用研究センター, 上席研究員(定常) (60293958)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | 薬物代謝酵素 / 遺伝子多型 / X線結晶構造解析 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
薬物代謝酵素CYP2C9は、複数の基質結合部位を有するアロステリック酵素である。これまでのX線結晶構造解析の結果より、ロサルタン結合部位が３箇所(①活性中心、②末梢、③アクセスチャネル）あることが明らかになっている。本研究では、CYP2C9野生型、及び各種変異型における３箇所のロサルタン結合部位の特性をX線結晶構造解析、分子間相互作用解析等により解析し、各々の部位での基質結合が、酵素の活性発現、基質認識、構造の可塑性に与える影響を解明することを目的とする。
本年度は、2C9*5（D360E), 2C9*28（Q214L), 2C9*2（R144C）を有する酵素を大腸菌に発現させて精製したところ、2C9.5はCO差スペクトルで450nmに吸収が認められずホロ酵素としては発現しなかった。精製酵素2C9.28 及び2C9.2の結晶化スクリーニングを行い、2C9.2の結晶を得た。2C9.2のX線結晶構造解析の結果、2C9.2は、2種類の結合様式でロサルタンと結合していることを明らかにした。2C9.2の活性中心におけるロサルタンの結合は、2C9野生型、及び2C9.3、2C9.30の結合様式とは異なった。一方、変異箇所であるR144C近傍の立体構造は野生型とほぼ類似していた。今後は2C9.2の立体構造の変化を詳細に解析し、ロサルタンの結合様式の違いと活性減弱との関連を明らかにする。
表面プラズモン共鳴(SPR)法より、ロサルタンと2C9野生型および変異型との結合における物理化学的なパラメーターを測定するにあたり、酵素のセンサーチップへ固定化方法と薬物相互作用測条件の検討を行った。His-tagtとNi-NTAの親和性に基づく固定化法を用いた場合、2C9酵素と薬物の結合を検出できたが、酵素の結合量の点で問題があった。今後は、抗 His-tagtag 抗体を用いた固定化法の検討を行う。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2C9*5（D360E)が大腸菌では発現できないことが判明し、この変異によりもたらされる構造やロサルタン結合様式の変化を明らかにすることは難しくなった。それ以外は順調に結果を得ている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
変異型（*3, *30, *28, *2)の活性測定を並行して行い、SPR法やX線結晶解析の結果との関連を明らかにする予定である。
|
| Causes of Carryover |
バイオシェーカーの購入を見送り、消耗品代にあてたたため、来年度使用額が発生した。来年度使用額は、次年度の消耗品代にあてる。
|
Research Products
(2 results)
