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2019 Fiscal Year Research-status Report

Effects of multiple binding sites of CYP2C9 on its allosteric modulation

Research Project

Project/Area Number 18K06613
Research InstitutionDoshisha Women's College of Liberal Arts

Principal Investigator

前川 京子  同志社女子大学, 薬学部, 教授 (70270626)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 安達 基泰  国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 量子生命科学領域, グループリーダー(定常) (60293958)
Project Period (FY) 2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords薬物代謝酵素 / 遺伝子多型 / X線結晶構造解析
Outline of Annual Research Achievements

薬物代謝酵素CYP2C9は、複数の基質結合部位を有するアロステリック酵素である。これまでのX線結晶構造解析の結果から、野生型にはロサルタンの結合部位が3箇所(①活性中心、②末梢、③アクセスチャネル)存在することが明らかになっている。今年度は、昨年度にX線結晶構造解析を行った*2(R141C)変異体について、ロサルタンとの結合様式を詳細に解析した。CYP2C9.2と野生型との間で最も大きな構造上の違いが認められたのはF-Gヘリックス間(Trp212からLys235)であり、各アミノ酸残基の向きが大きく異なっていた。活性中心のロサルタンは、野生型ではビフェニル環をヘム鉄に向けて結合していたのに対し、CYP2C9.2ではイミダゾール環の塩素原子をヘム鉄に向けて5Åの距離で結合していた。CYP2C9.2では活性中心のロサルタンは、そのビフェニル環とF476残基との間で形成されたππ結合によりアクセスチャネル側に結合していた。この結果、アクセスチャネルへの2分子目のロサルタンの結合が妨げられている可能性があり、*2が活性低下アレルであることと関連していることが示唆された。
表面プラズモン共鳴(SPR)法による薬物相互作用解析では、アミンカップリング法によりセンサーチップへ固定化した野生型CYP2C9と各種薬物との結合を薬物濃度依存的に確認した。しかし、1:1 Bindingモデルでは良好なフィッティング結果は得られず、薬物がCYP2C9に結合した後に構造が変化し、さらにCYP2C9と薬物の間で相互作用が起こっているのではないかと考えられた。等温滴定カロリメトリー(ITC)法を用いた相互作用解析を行うにあたり、CUP2C9濃度とリガンド濃度の予備検討を行った。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

SPR法による測定では、良好なフィッティング結果は得られていないため今後、測定条件を検討していく必要がある。一方で、SPR法とITC法の両者で得られた結果を相互に比較することが重要と考えられ、先にITC法の測定条件の予備検討をすすめることとした。

Strategy for Future Research Activity

ITC法では、使用するCYP2C9タンパク質の量がSPR法と比較して非常に多いことから、大腸菌での発現量の増加を目的に、発現プラスミドや培養条件の最適化をすすめる。また、結晶化を容易にするため、より純度の高いタンパク精製の検討も行う。

Causes of Carryover

バイオシェーカーの購入を見送り、今年度は、解析や予備検討を主に行ったため、年度使用額が発生した。次年度使用額は、次年度の消耗品代にあてる。

Research Products

(3 results)

All 2020 2019 Other

All Int'l Joint Research (1 results) Presentation (2 results)

  • [Int'l Joint Research] Albany College(米国)

    • Country Name
      U.S.A.
    • Counterpart Institution
      Albany College
  • [Presentation] 薬物代謝酵素CYP2C9の構造活性相関研究のための大腸菌における発現系 の改良に関する研究2020

    • Author(s)
      堀田 美翔、南 幸穂、北 奈都水、瀨古 寿々菜、大石 真理子、髙橋 知里、安達 基泰、前川 京 子
    • Organizer
      日本薬学会第140 年会
  • [Presentation] Crystal Structure of CYP2C9*2 Genetic Variant in Complex with an Angiotensin II Receptor Blocker Drug Losartan2019

    • Author(s)
      Chisato Takahashi, Natsumi Kita, Yukiho Minami, Mika Horita, Mai Katsuragi, Risako Kitani, Motoyasu Adachi, Keiko Maekawa
    • Organizer
      日本薬物動態学会 第34回年会 つくば

URL: 

Published: 2021-01-27  

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