2018 Fiscal Year Research-status Report

Investigation of the folding mechanism of PrPC to PrPSc and assembly of prion agents, and interpretation of the of the beta helix scaffold model

Research Project

Project/Area Number	18K06621
Research Institution	National Institute of Infectious Diseases
Principal Investigator	萩原健一国立感染症研究所, 細胞化学部, 室長 (40192265)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	プリオン / アミロイド / βへリックス
Outline of Annual Research Achievements	βへリックス構造を有するP. anserina由来のHet-s蛋白質、E. coli由来のLpxA蛋白質およびlacA蛋白質のそれぞれの遺伝子をクローニングし、これらの蛋白質の立体構造中でβへリックス構造を形成することが知られている部分を幾つか系統的に選び、そのcDNAをマウスの正常型プリオン蛋白質（PrPC）のcDNAへ移植・置換した。また、当初の計画には無かったが、ニワトリ・PrPCとマウス・PrPCの種々のキメラ蛋白質遺伝子（キメラcDNA）を作製した。次いで、マウス馴化プリオンが感染してPrPCから異常型プリオン蛋白質（PrPSc）への変換が持続的に起きているマウス培養細胞（神経芽細胞腫由来）へこれらのcDNAを導入して発現させ、プリオン感染細胞が有する「PrPCからPrPScへの変換能・変換機構」において、発現させた置換体やキメラ体が基質となってPrPSc様の蛋白質凝集体を形成するか否かを調べた。これまでの実験の結果、マウス・PrPCの112から155番目の44個のアミノ酸をニワトリ・PrPCの126から169番目のアミノ酸を配列で置換したキメラが、全長のアミノ酸配列がマウス型のPrPCがPrPScへ変換される効率より低いものの、プロテアーゼK消化に対して抵抗性の凝集体を形成することがわかった。この実験とは別に、プリオンに感染した動物の脳組織に蓄積したプリオンに対して光架橋反応（Proc Natl Acad Sci USA, 1999; 96: 6020）を試みたところ、プリオンの凝集体構造を考察する手がかりとなる実験データが予想外に得られた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 計画どおりにβへリックス含有蛋白質のcDNAクローニングを完了し、移植・キメラ遺伝子を作出した。また、プリオンに感染した動物の脳組織に蓄積したプリオンを対象として光架橋反応を試み、予想外の興味深い結果を得た。
Strategy for Future Research Activity	当初の計画に沿って、作製した移植・キメラ蛋白質遺伝子をプリオン持続感染細胞に発現させ、感染細胞が有するPrPC→PrPSc変換能において、人為的に導入したβへリックス等のアミノ酸配列がどのように振る舞うのかについて引き続き系統的に検討する。また、キメラ蛋白質遺伝子を大腸菌や昆虫培養細胞で発現させ、アミロイド凝集体を形成するキメラ蛋白質をチオフラビンTの蛍光染色、プロテアーゼKへの抵抗性、によりスクリーニングしたい。研究計画時には、以上の結果をin vivo実験（マウスへの投与により内在PrPCの凝集が誘起されるかという点の検証）へ繋げたいと考えていたが、その後の情報収集・考察からin vivo系が必ずしも適した実験手法ではないことも考慮される。In vivo系が適さないと判断される場合には、計画書に述べたin vitro系を活用した検討へ繋げる。また前年度において、プリオンに感染した動物の脳組織に蓄積したプリオンに対して光架橋反応を試みた。次年度も、この光架橋反応や化学反応に基づく解析を進めて、プリオンはどのような凝集状態のPrPScによって構築されているのかという点について、生化学的データに基づく考察を深める。
Causes of Carryover	本年度中に論文掲載に至らなかったため、論文掲載費の予算額が未使用となった。また、研究計画書申請時には開催地が未公表だった学会（アジア太平洋プリオン研究会）が都区内で開催されたため、旅費が不要となった。予備実験の段階において、既製の蛋白質電気泳動ゲルの代わりに自製品の適宜使用、プラスチック製品の再利用、等により消耗品費（物品費）の支出を抑えることができた。使用計画：論文掲載費および試薬などの消耗品費として使用する。