2019 Fiscal Year Research-status Report
心筋カリウムチャネル複合体を介した心筋興奮終焉期の電気―Ca2＋同期機構の検証
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18K06683
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
児玉 昌美 東京大学, 定量生命科学研究所, 特任研究員 (30512248)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
黒川 洵子 静岡県立大学, 薬学部, 教授 (40396982)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | イオンチャネル / 分子間相互作用 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、IKsチャネル分子複合体が、心筋興奮終焉期の同期システムとして機能する可能性を検証することよって、心筋の恒常的な電気活動とその破たんである不整脈におけるIKsチャネル分子複合体の役割を明らかにすることである。成体ヒトIKsチャネルトランスジェニック(IKsTG)マウスの心室細胞抽出液から、免疫沈降法でIKsチャネル分子複合体を単離した際、質量分析(連携研究者; 永森)によって、相互作用する分子を新たに網羅的に探索したところ、Na+/Ca2+交換輸送体(NCX1)が同定されたことから、この分子に着目し、研究を進めた。
この時、質量分析で同時に同定されたタンパク質をパスウェイ解析したところ、カルシウムシグナリングが最上位であったこと、また昨年度、同定したKCNQ1上の相互作用領域はカルモジュリン（CaM）とも複合体を形成し、生理条件下で上昇したCa2+が、CaMとの複合体を介してIKsチャネルを活性化することが報告されていることから、やはり昨年度に確立した、野生型イヌまたはモルモットの心室細胞抽出液とIKsチャネルの細胞内領域―GST融合タンパク質を用いたGSTプルダウンアッセイにおいて、Ca2+濃度の異なる緩衝液や、カルシウムキレート剤、CaM阻害剤を用いてIKsチャネルとNCX1の複合体形成におけるCa2+によるCaM活性化の関与を検討した。結果はいずれの場合においても、複合体形成におけるCaMの活性化の関与は否定的であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究においては、研究開始当初、IKsチャネルとNCX1の機能連関に両分子の複合体形成が必要か否かが１つのカギになるものと考えていた。そのため、昨年度までに明らかにした、KCNQ1上の相互作用領域が報告されているCaMとの相互領域の近傍であったことも鑑み、CaMの活性が両分子の複合体形成に関与しているか検討を行った。結果は否定的であったが、実験を通して複合体そのものがCa2+動態にかかわらず安定的であることが示唆されたことは進展と受け止めた。
一方、複合体形成の生理学的もしくは病理学的意義の解明に必要な電気生理学的実験には遅れがある。原因の一つとして、昨年度同定したKCNQ1上の相互作用領域に相当するペプチドの調整に手間取ったことが挙げられるが、これについては発現系を大腸菌からバキュロウィルスに変えることによって、発現時の分解および可溶性を大幅に改善でき、既に解決済みであることから、遅れは限定的であると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究では、まずDuolink法（定量的二分子間相互作用検出用染色法）を用いて、実験計画中の分子複合体の細胞内局在の定量化を行い、IKsチャネル分子複合体の細胞内局在比を明らかにする。今年度、複合体はCa2+動態にかかわらず安定であることが明らかになったことから、内在性KCNQ1非検出のマウス心筋培養細胞HL-1（NCX1は検出された）に、野生型／複合体形成不可の変異型KCNQ1を強制発現して用いる。
IKsチャネルの機能連関については、電気生理学的解析を行う。研究計画に基づいて、ホールセルパッチクランプ法でIKs電流を計測し、NCX阻害剤(YM 244769/KB-R7943)がIKsチャネル活性に与える効果を調べる。複合体形成とは異なり、機能連関については、Ca2+動態が関与する可能性が残されているため、結果に応じて、必要が認められる場合には、カルモデュリン・Ca2+ポンプなどのNCX1以外のCa2+動態関連因子の阻害剤についても解析を行う。
生化学・分子生物学的実験では、KCNQ1上の相互作用領域に相当するペプチドを精製し、このペプチドを添加することで分子複合体形成を競争的に阻害できるかをin vitro GSTプルダウンアッセイで確認する。複合体形成を阻害できれば、電気生理学的実験に応用し、NCX1によるIKsチャネルの機能制御に、複合体形成が必要か否かを明らかにする。ペプチドによる複合体形成阻害がうまくいかなかった場合は、野生型／複合体形成不可の変異型KCNQ1を、HL-1細胞に強制発現して用い、コンピュータシミュレーションによる分子複合体の機能の検証につなげる。
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