細胞接着分子が制御する細胞小器官の配置と鞭毛形成の分子機構

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06834
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 若山 友彦 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 教授 (70305100)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 玉井 郁巳 金沢大学, 薬学系, 教授 (20155237)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 細胞接着分子 / 細胞小器官の配置 / ミトコンドリア / 鞭毛形成 / 形態形成

Outline of Annual Research Achievements

細胞接着分子CADM1が尾部のミトコンドリアの配置と鞭毛形成を制御する分子機構を明らかにするため、Yeast-Two-Hybridシステムにより、CADM1と直接結合するアダプター蛋白質BSPRYを同定した。しかし、BSPRY遺伝子欠損マウスの精巣は小さいが、CADM1で観察された様な精子形成障害は見られなかった。そこで、BSPRY抗体で免疫沈降をして質量分析で解析をしたところ、細胞内蛋白質Iba-1等の多数の分子が沈降産物に含まれていた。Iba-1の発現は、CADM1遺伝子欠損マウスの精巣で、著しく減少していた。そこで、同定した分子とCADM1、BSPRY, Iba-1との結合を明らかにするとともに、これらの分子の精巣での発現を検討することにより、CADM1を中心とした分子群を明らかにすることを目的として研究を行った。
BSPRY抗体とIba-1抗体により免疫沈降と質量分析を行った。その結果、56種類の分子を新たに同定した。そこで、in vitroのアッセイ実験系であるVIPアッセイにより、分子間相互作用をスクリーニングを順番に行った。VIPアッセイにより26種類の分子の相互作用を検討した。BSPRYとIba-1との相互作用をそれぞれ確認できた分子があったが、CADM1との相互作用をする分子が同定できなかった。
したがって、残った分子について引き続き相互作用を検討する。相互作用が確定できた分子が同定できた場合、CRISPER/Cas9システムにより遺伝子欠損マウスを熊本大学動物資源開発研究施設(CARD)に依頼して作製する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

免疫沈降により新たに同定した分子が50種類を越え、その検討に時間を要している。しかしながら、これらの分子の中に、重要な分子が含まれている可能性が高く、その精査は新たな知見を得るために重要な行程である。したがって、時間はかかっているが着実に成果は出ているので、引き続き研究を進めていく。

Strategy for Future Research Activity

BSPRYとIba-1の免疫沈降と質量分析により、同定した56種類の分子の内、VIPアッセイをしていない30種類の分子についてVIPアッセイを行う。CADM1と相互作用をする分子が同定できるまで行う。相互作用が確定できた分子が同定できた場合、CRISPER/Cas9システムにより遺伝子欠損マウスを熊本大学動物資源開発研究施設(CARD)に依頼して作製する。

Causes of Carryover

細胞接着分子CADM1と相互作用する新規分子が同定できた場合、新たな遺伝子改変動物を作製する計画であったが、候補分子が多く、その絞り込みに時間がかかった。相互作用分子が同定できた場合、遺伝子改変動物を作製する必要があるため、その費用を次年度に繰り越す必要が生じたため。