2021 Fiscal Year Research-status Report
Mechanisms of ATP-release in Cancer Cells
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18K06851
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
古家 喜四夫 名古屋大学, 総合保健体育科学センター, 研究員 (40132740)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ATP放出 / ルミネッセンスイメージング / がん微小環境 / 乳がん細胞 / 低張刺激 / S1P / VRAC / LRRC8 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
がんは自らの周りに生存を維持するための微小環境を構築しており、そこにはATPが高濃度で存在する。このATPの大きな役割は分解によりアデノシンを生成、高濃度に維持することにより、がんに対する免疫攻撃を抑制することである。しかしがん微小環境においてATPが高濃度に維持されるメカニズムは分かっていない。本研究は、私たちの開発したATPリアルタイムイメージング法を用いて見出すことのできたがん細胞特異的なATP放出現象の機序と役割を明らかにし、がんにおけるATPシグナリングを解明することを目的としている。これまでに、低張刺激によって未分化の細胞株特異的に散漫的持続的なATP放出がみられ、それが容量調節性Cl-チャネル(VRAC)の阻害剤であるDCPIBでのみ阻害され、VRACの必須サブユニットであるLRRC8Aのノックダウン細胞において抑制されることからVRACの関与を確証した。このATP放出は低張刺激だけではなくがん微小環境にも多く存在する炎症性物質Sphingosine-1-Phosphate (S1P)で細胞容積変化を伴わずに活性化され、LRRC8Aのノックダウン細胞では抑制されることや乳がん細胞ではS1P受容体が多く発現していることなどからがん微小環境のATP放出に関してS1Pが重要な働きをしていることを示唆した。今年度そのS1Pの濃度依存性を決め、阻害剤やPCR実験によりサブタイプS1P1-5の中S1P1とS1P2が関与していることを明らかにした。これらの結果は学会で発表するとともに学術誌に論文として掲載された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
低張刺激によって未分化の乳腺株細胞において分化した細胞とは異なったパターンのATP放出機序を見出した。それが容量調節性Cl-チャネル(VRAC)の阻害剤であるDCPIBで阻害され、VRACの分子実体であるLRRC8AをsiRNAによる一時的な発現阻害、アデノウィルスを用いたshRNAの恒常発現株細胞作製によるノックダウンにより抑制されたことからVRACを介したATP放出であることを明らかにした。乳腺株細胞にはLRRC8A,C,Dのサブファミリーが多く発現しておりそのことを支持する。さらに炎症性物質Sphingosine-1-Phosphate(S1P)が細胞容積変化を伴わずにVRACを活性化すること、乳がん細胞においてS1P受容体(S1P1, S1P2)が発現していることなどを明らかにし、がん微小環境でS1Pが重要な役割を果たしていることを示唆した。これらの結果を論文にまとめることができ、ほぼ当初の計画どおり順調に進んでいるということができる。
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| Strategy for Future Research Activity |
低張刺激およびS1P刺激による未分化細胞特異的なATP放出機序はVRACの主要構成分子であるLRRC8Aのノックダウンによって抑制されることを明らかにしたが、そのisoformsであるLRRC8B-Eの寄与は明らかではない。これらisoformsのノックダウン実験でATP放出との関連を確認していく。また等張条件下においてATP放出を誘起するS1Pはがん微小環境にも多く存在することからがんにおけるATP放出に深く関与していると考えられる。S1P受容体とVRAC活性化の機序を明らかにする。また論文投稿時指摘された細胞の代謝とATP放出の関連について細胞代謝アナライザーなどを用いて代謝経路とATP放出経路との関連を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
論文投稿のためのデスクワークに多くの時間を割き、2つの論文を仕上げることができた。その分実験にかける時間が少なくなり、またラボの移動に伴う引っ越しがあったため3ヶ月ほど終盤は実験ができず、実験遂行のための出費が抑えられた。次年度は限られた時間と経費であるが上記のように最後のまとめに必要な実験をできる限り行う。
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