2018 Fiscal Year Research-status Report
ホスホランバンを標的とした新たな環状ペプチド薬の創出と心不全治療薬への応用
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18K06892
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
本田 健 山口大学, 大学院医学系研究科, 講師 (30457311)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
酒井 大樹 山口大学, 大学院医学系研究科, 助教 (40464367)
乾 誠 山口大学, 大学院医学系研究科, 教授 (70223237) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 環状ペプチド / 心不全 / ホスホランバン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
心不全では、心筋小胞体へCa2+を取込むポンプ活性が障害されており、このポンプの阻害因子であるホスホランバン(PLN)の抑制は心不全の改善に繋がることから、PLNは創薬標的として注目されている。本研究では、立体構造の多様性、安定性と分解耐性を持つ環状ペプチドに注目し、化学架橋法によるペプチド環状化とmRNA/cDNA display法を組合せた新たな網羅的探索法を構築して、PLN機能を阻害する環状ペプチドを心不全治療薬として創出する。初年度は、主にその手法の構築を目指した。ペプチド環状化は、分子内に3つのシステインを配置し（2つの挟まれたランダム配列は各５残基）、これをtris(bromomethyl)benzene (TBMB)で架橋する方法を採用した。このDNAライブラリから転写したmRNAとピューロマイシン(Pu)搭載DNAリンカーを酵素リガーゼにより連結した。これを無細胞合成系で翻訳すると、Pu を介してmRNAとペプチドが結合するが、収率が低く、その主因はPuリンカーとmRNAの連結効率にあった。そこで、相補鎖塩基と光架橋しうるCyanovinylcarbazole修飾オリゴを導入したcPuリンカーを新規に合成し、結合効率を大幅に改善することに成功した。翻訳後、mRNAは逆転写にてcDNA化した。次にペプチド部分の分子内架橋だが、分子間架橋による重合反応が課題であった。希釈および空気酸化の条件を合成ペプチドにて最適化し、核酸鎖-cPuリンカー-ペプチドライブラリに適用した。標的であるPLNについては、PLN細胞質ドメインとGSTとの融合蛋白質を発現、精製してグルタチオンビーズに固定化した。これに環状ペプチドライブラリを作用させ、結合したものをPCRで増幅、得られたDNAを再び転写、という手順にて選別操作を現在繰り返している。綿密な条件検討に時間を費やしたが、環状ペプチドの効率の良い網羅的探索手法を構築することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
環状ペプチドの効率の良い網羅的スクリーニング手法は新たな挑戦的試みで、各種反応の条件検討や特殊な合成を要するPuroリンカーに時間を要した。また、スクリーニングでは系の反応効率が結果を大きく左右するため、光架橋を可能とするc Puroリンカーの系に切り替えたが、特にこの過程でかなり時間を費やしてしまった。しかしながら、今後より優秀な目的のペプチドを得ることが、本研究では極めて重要になるため、多少の時間を犠牲にしても効率の良いライブラリ構築およびスクリーニング法が開発できたことは収穫であり、必要なことであった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はPLNに結合する環状ペプチド候補について、PLN活性の阻害という機能面に着目しながら、より最適なものを絞り込んでいく。また、得られたペプチドに付随するDNA鎖から配列情報を読み取り、まずはその合成ペプチドを準備する。PLNへの結合スクリーニング過程では、ペプチドに核酸鎖がリンクしている状態であるため、純粋にペプチドのみで活性があるのかを調べる。また、その合成ペプチドについてTBMBによる架橋の有無で活性に変化が生じるかを評価し、環状構造の寄与を調べる。また、構造最小化も行いながら、最適な環状ペプチドを絞り込んでいく。さらに、これらのペプチドの膜透過性を調べ、必要に応じて膜透過性修飾を行っていく。
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| Causes of Carryover |
ホスホランバン（PLN）に結合する環状ペプチド候補を得て、それらのPLN機能阻害活性を測定する予定であったが、次年度に引き継ぐことになったため、それらの実験にかかる費用が次年度使用額として生じた。
次年度では、心筋小胞体マイクロソームを心筋細胞より単離し、これに含まれるCa2+ ATPaseであるSERCAのCa2+ポンプ活性を測定する。PLNはSERCAポンプ機能を阻害するが、その阻害活性に対して、得られた環状ペプチド候補がどれだけ抑制作用を示すかについて、SERCAのCa2+ポンプ活性の増加率から判断する。そのため、次年度には、マイクロソーム調製のための、試薬類やホモジナイザー等の器具類を購入し、さらにSERCAの活性測定アッセイに必要な試薬類、また環状ペプチドに活性があった場合はより詳細に調べるために、改めてそのペプチドを大量に調製するための試薬類を購入する。
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