2020 Fiscal Year Research-status Report
蛍光タンパク質ノックインによる上皮メカノセンサーの分子数計測
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18K06932
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
栗栖 修作 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 助教 (40525531)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | CRISPR/Cas9 / ゲノム編集 / ノックイン / 細胞間接着 / メカノバイオロジー / メカノセンシング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
上皮細胞の機械刺激への応答性（メカノセンシング）の分子メカニズムを解明するためには、そこで働く様々な分子の量的動態を知ることが一つの有力な方法となる。しかし、内在性タンパク質の「量」を知る手段は現在のところ確立されていない。本研究ではゲノム編集技術を用いて内在性のタンパク質に蛍光タンパク質タグを付加し、その蛍光強度を比較することで種々のタンパク質の相対量を決定することを第一段階の目標としている。さらに次の段階として、その技術を用いて量的側面から上皮メカノセンシングの新たな動作原理を解明することを目指している。マウス乳腺上皮細胞株EpH4を用い、これまでに上皮細胞間接着でメカノセンシングに関わる７遺伝子（CDH1, CTNNA1, VCL, TJP1, TJP2, ACTN1, ACTN4）に対して、そのタンパク質C末端に緑色蛍光タンパク質GFPをホモ接合でノックインした７種類の細胞株を樹立した。また、３遺伝子（CDH1, CTNNA1, TJP2）については赤色蛍光タンパク質RFPのホモ接合ノックイン細胞株も作製することができた。現在GFPタグのノックインに成功した遺伝子７種について、その蛍光強度の比較から細胞間接着におけるタンパク質の存在量比を決定することができている。2020年度はこれらのGFPまたはRFPノックイン細胞株を利用して、細胞間接着に応力変化が生じる状況でこれらのタンパク質にどのような量的変化が見られるかについて解析を行った。その結果、vinculin（VCL遺伝子）とZO-1（TJP1遺伝子）は細胞間接着にかかる応力を人為的に変えた場合、その存在量や接着複合体の内部での微小な分布パターンが変化することを見出した。この結果の意味するところについて現在解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
これまでに７種のタンパク質について細胞間接着における存在量比を決定できた。これまでの多くの研究例と同じくE-cadherin（CDH1遺伝子）とalpha-catenin（CTNNA1遺伝子）は１：１の量比で存在することが確認できた。本研究では上皮細胞間接着の形成初期にあたるpunctate adherens junction（pAJ）におけるタンパク質量を調べているため、成熟した接着で発達するタイトジャンクション（TJ）の構成タンパク質の存在量は少ないことが予想された。しかし意外なことにZO-1やZO-2（TJP2遺伝子）の存在量を計測したところ、その合計量（ZO-1+ZO-2）はE-cadherinの存在量と同程度となった。この結果はTJが細胞構造としてマクロな形態をとる前の初期段階から、その部品となる構成因子が細胞間に集積していることを意味しており、TJ形成の新たな一面を見出すことができたと考えている。
また本年度は上皮細胞間接着のメカノセンシングの機構について実験を進めた。本研究ではII型ミオシンのモーター活性を抑制するブレビスタチン（Bbs）を用い、アクチン細胞骨格を介したpAJへの応力を減弱させタンパク量の変化を追った。VinculinはBbs処理によって細胞間接着から急速（１０分以内）に失なわれ、その後約１時間かけてpAJの構造自体も消失した。一方、ZO-1はpAJが消失した後も細胞間に斑状に残り続けた。つまり各タンパク質で応力変化に対するレスポンスが異なることが分かってきた。さらに５分間のBbs処理によって一つの斑点状のpAJの内部でvinculinとZO-1の局在が分離することが観察された。すなわち、これら二つの結果から応力刺激が失われるとpAJはその構成要素を段階的に失い、崩壊へ向かうことが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの結果は固定細胞を用いて得られたものである。当初、2020年度の課題としていたライブイメージングによる定量解析は技術的な問題から、未だ信頼できる計測が出来ていない。まず抗E-cadherin抗体による免疫染色法に頼っていた観測領域（pAJ）の検出・決定、これに代替する生細胞におけるpAJ検出法が見つかっていない。前年度から検討していたいくつかのpAJ検出法も誤差が大きく不適であることが判明した。
そこで今年度はpAJの厳密な領域決定をせずにライブイメージングを行うことを予定している。これにより正確性に欠けるものの、各細胞間接着タンパク質の量的変化の大まかな傾向は掴むことが可能である。最終的に細胞間接着での応力変化に応じた各構成タンパク質の変動をリアルタイムで検出し、各タンパク質の量的ダイナミクスを解明することを目標とする。この生細胞での結果とこれまでに得られている固定サンプルでの結果から、応力応答性のタンパク質の量的変動の傾向をまとめ、その成果は原著論文として国際誌に発表する。今年度は最終年度であるため、なるべく早い段階から論文作成に着手し、研究期間内に成果発表できるよう対応していく。
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| Causes of Carryover |
ゲノム編集によって各遺伝子にGFPやRFPをホモ接合ノックインした細胞株のうち、vinculin-GFP細胞株のゲノムシーケンスを確認したところ、vinculinタンパク質C末端の３アミノ酸が欠損していることが判明した。この欠損はvinculinのアクチン結合能に大きく影響することが分かり、vinculin-GFP細胞株を再度樹立し直したため実験計画が大幅に遅延した。研究実施期間の延長をし、いくつかの実験と成果発表のための学会参加費、論文作成のための費用などを次年度に使用することとし、次年度使用額が発生している。
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Research Products
(1 results)
