2018 Fiscal Year Research-status Report
多段階発がん過程におけるMeis1経路の網羅的機能解析
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18K07080
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| Research Institution | Chiba Cancer Center (Research Institute) |
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Principal Investigator |
若林 雄一 千葉県がんセンター(研究所), がんゲノムセンター 実験動物研究部, 部長 (40303119)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
磯貝 恵理子 千葉県がんセンター(研究所), 発がん研究グループ 実験動物研究室, 上席研究員 (40300917)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 扁平上皮がん / DMBA / TPA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
変異原性物質であるDMBA（dimethylbenz(a)anthracene）と炎症剤であるTPA（tetradecanoyl-phorbol-acetone）を用いて誘導した良性腫瘍パピローマ、皮膚扁平上皮がん、コントロールとして正常皮膚からクロマチンを分離し、anti-Meis1抗体を用いて免疫沈降を行い、沈殿したクロマチンからDNAを抽出してsequencingを行うというChIP sequencingを行った。その結果、悪性腫瘍において48のMeis1結合ピークが検出された。次に、これらのピークがシス領域に存在すると考えられる遺伝子を抽出したところ10個の遺伝子が検出された。このうち、4つの遺伝子（Dedd2、Sh2b1、Cep120、Stk25）の発現がMeis1ノックダウン細胞からRNAを抽出してqRT-PCRを行い発現を確認したところ、Meis1の発現と連動することを確認した。これらの遺伝子の中から耐糖能との関連が知られるStk25遺伝子の機能解析から行った。Stk25のノックダウン細胞株を皮膚扁平上皮がん細胞のB9を用いて作製した。するとこの細胞株はMeis1ノックダウン細胞株と同様に細胞遊走と増殖能に異常を来すことが判明した。さらにプロモーター領域をクローニングしてルシフェラーゼアッセイを行った。Meis1の全長cDNA配列とStk25のプロモーター領域を連結させたルシフェラーゼコンストラクトを同時にB9細胞にトランスフェクションしたところ、強いルシフェラーゼ活性が検出され、Stk25がMeis1の下流で機能することが確認された。Meis1ノックダウン細胞株にStk25を高発現させたところ、遊走能にはそれほど影響を与えなかったが、増殖能はレスキューされるという結果が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
DMBA（dimethylbenz(a)anthracene）と炎症剤であるTPA（tetradecanoyl-phorbol-acetone）を用いて誘導した良性腫瘍パピローマ、皮膚扁平上皮がん、コントロールとして正常皮膚からクロマチンを分離し、anti-Meis1抗体を用いて免疫沈降を行い、沈殿したクロマチンからDNAを抽出してsequencingを行うというChIP sequencingを行い、ピークが得られた。すなわち、primary tumorsから分離したクロマチンを用いたChIP sequencingの実験系が期待した通りに動き、その結果、検出されたStk25がMeis1の下流で機能するという結果が得られた。さらにはこれらの結果をvalidationするために皮膚扁平上皮がん由来細胞株から調整したクロマチン分画を用いてクロマチン免疫沈降を行った。これらの解析結果はまだ得られていないが、十分なクロマチン量が得られていることからsequencing反応に進む準備は整ったと考える。以上から、予定した実験内容はおおむね順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
皮膚扁平上皮がん由来細胞株から調整したクロマチン分画を用いてクロマチン免疫沈降を行ったサンプルのsequencingを進め、validationを行う。さらにはStk25以外のDedd2、Sh2b1、Cep120についてもノックダウン細胞株を調整して機能解析を進める。クルマチンのみならず、RNAを用いたトランスクリプトーム解析も進め、Meis1経路の機能解析を網羅的に進める。
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| Causes of Carryover |
初年度はデータ解析に時間を費やしたこと、また、手持ちの試薬等でまかなえたことから、残金が生じた。次年度以降は実際の検証実験に時間、試薬を費やすことから、残金の使用が見込まれる。
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