2019 Fiscal Year Research-status Report
閉環状DNAとして染色体外に存在するB型肝炎ウイルスゲノムの維持と分解機序の解明
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18K07160
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
山本 直樹 公益財団法人東京都医学総合研究所, ゲノム医科学研究分野, 主任研究員 (10547780)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | HBV / cccDNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
B型肝炎ウイルス(HBV)は感染細胞の核内において二本鎖閉環状DNA(covalently closed circular DNA: cccDNA)として染色体とは独立して一定量存在していることが知られている。これまで、逆転写阻害剤やHBV mRNA標的siRNA、インターフェロン(IFN)投与ではcccDNAは効果的に低下しないことを示してきた。一方、IFN応答因子がcccDNA量の減少に関与していることが報告されている。そこで本研究は、化合物スクリーニングから得られたcccDNA量を減少させる新規抗HBV低分子化合物の作用機序を解析すると共に、cccDNAの維持および分解機序を解明することを目的とする。
2019年度は以下の4点について研究を進めた。①2018度までに構築したcccDNA特異的定量PCR法を用いて、新規抗HBV化合物の初代ヒト肝臓キメラマウス化培養細胞におけるHBVゲノムDNA(relaxed circular DNA: rcDNA)、cccDNAおよびHBV抗原に対する50%抑制濃度を検討した。②誘導体を合成し、2018年度に明らかにした抗HBV効果に関わる官能基の性質について検討した。③低分子化合物ライブラリーを用いて新たな抗HBV化合物を探索した。④肝臓に近いIFN応答性を有するNTCP安定発現HepG2細胞を基に、HBV遺伝子型AとCの安定発現細胞をそれぞれ構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、新規抗HBV低分子化合物のcccDNA量低下機序を解析すると共にcccDNAの維持および分解機序を解明することを目的としている。申請者はこれまで、HBV rcDNA、cccDNA定量PCR法を構築してきた。2019年度は新規低分子化合物のcccDNA量低下機序の解明を目指して、初代ヒト肝臓キメラマウス肝培養細胞におけるrcDNA、cccDNAおよびHBV抗原に対する50%抑制濃度を明らかにした。そして、新たに合成した誘導体を用いた実験から、新規抗HBV低分子化合物の活性に関わる官能基の同定とその性質を明らかにした。これらの結果は、化合物の抗HBV作用機序の解析に重要な情報である。化合物ライブラリースのクリーニングにより、上記とは別に複数のcccDNA抑制効果を示す新規低分子化合物を見出した。これは、抗HBV効果に関わる化合物の構造解析に資すると考えられる。
効率的なcccDNAの維持および分解機序解析を進める為、遺伝子型AとCのHBV安定発現HepG2-hNTCP細胞を新たに構築した。この細胞は、親株であるHepG2細胞よりも外来遺伝子の導入効率が高かったことから今後のcccDNA制御機序解析に有用なツールとなる。
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| Strategy for Future Research Activity |
2020年度は、cccDNAの維持および分解に関わる宿主因子の同定と機序解析を進める。具体的には、HBVライフサイクルにおける新規抗HBV低分子化合物の作用点を解析する。cccDNAは感染細胞核内において宿主染色体とは独立したミニ染色体構造として数コピー程度で維持されている。このcccDNA複合体に相互作用する宿主因子とウイルス因子は多数報告されているが、cccDNAの維持と分解機序には不明な点が多い。また、新規抗HBV低分子化合物の標的因子は不明である。そこで、 cccDNA複合体を効率的に精製する手法を構築する。そして、cccDNA複合体に相互作用してその維持と分解に関わる制御因子を蛋白質レベルで探索する。さらに、2019年度までに構築した外来遺伝子の導入効率が高いHBV安定発現HepG2-hNTCP細胞および初代ヒト肝臓キメラマウス肝培養細胞を利用して、cccDNA制御因子を同定し作用機序の解明を進める。
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| Causes of Carryover |
2019年度はcccDNA量低下効果に関わる化合物の解析を優先して進めてきた為、宿主およびウイルス因子解析にかかる経費が抑えられ次年度使用額が生じた。2020年度は、cccDNAの維持と分解に関わる宿主およびウイルス因子の解析に使用する予定である。
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