2018 Fiscal Year Research-status Report
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18K07205
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
長尾 和右 北里大学, 医学部, 講師 (60392487)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ソニックヘッジホッグ / PTCH1 / CRISPR/Cas9 / iPS細胞 / 母斑基底細胞癌症候群 / NBCCS |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では高発癌を特徴としPTCH1を疾患責任遺伝子とする優性遺伝病である母斑基底細胞癌症候群 (NBCCS) 患者由来細胞に対して、残存しているPTCH1正常アレルに遺伝子編集ツールであるCRISPR/Cas9システムを利用してセカンドヒットに相当する変異を導入したiPS細胞を作製し、マウスに移植後腫瘍形成能を解析することを目的とした。
これまでの予備実験等を踏まえて、当研究室に蓄積されたNBCCS症例のうち比較的単純な遺伝子変異を持ついくつかの症例を対象として患者由来細胞に対して遺伝子編集を行い、最終的にPTCH1遺伝子2アレルに変異を持つiPS細胞を複数クローン樹立した。またこれと並行して、同症例を用いて変異PTCH1アレルを正常配列に修復したiPS細胞を複数クローン樹立した。
PTCH1遺伝子の2アレルに変異を持つiPS細胞と親株である患者由来iPS細胞を用いて生化学的解析を行ったところ、PTCH1(-/-) iPS細胞は細胞増殖能が亢進しており、ソニックヘッジホッグ (SHH) シグナル伝達系標的遺伝子の発現量も上昇していることが、それぞれMTSアッセイおよびRT-qPCRの結果明らかとなった。NBCCS患者由来iPS細胞は正常人由来iPS細胞と比べ、増殖能およびSHHシグナル伝達系標的遺伝子の発現量に有意差がないことが明らかとなっているが、本研究の結果から、PTHC1の機能が完全に失われることで細胞増殖能とSHHシグナル伝達系標的遺伝子の発現量が共に亢進することが明らかとなった。これはがん発生の2 hit仮説に矛盾しない結果である。
現在これらのiPS細胞株をマウスの皮下に移植して腫瘍形成能を解析中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題の大きな山の一つが遺伝子編集済みiPS細胞クローンの樹立である。この点に関して、当研究室に蓄積されたNBCCS症例のうち複数で実行可能であったことから、研究計画はおおむね順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
近年iPS細胞を様々な組織の細胞に分化誘導する方法が確立されつつあり、その一つにケラチノサイトへの分化誘導を経た皮膚の3次元培養法がある。本研究課題の対象であるNBCCS症候群では髄芽腫および基底細胞癌の好発が特徴であり、それらの癌を患者由来iPS細胞を用いて再現することが研究目的である。
そこで追加の研究計画として、遺伝子編集を行ったiPS細胞に対してケラチノサイトへの分化誘導を行い、皮膚3次元培養を経て基底細胞癌の再現が可能であるかを並行して進行中である。
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| Causes of Carryover |
本研究計画は順調に進展中であり、当初予定研究費をおおむね使用した (99.3％)。本研究で使用しているiPS細胞の継代・維持に使用する培地・試薬類は比較的高額なものが多く、次年度は研究計画書に記載したiPS細胞のマウスへの移植実験に加えて、in vitro分化誘導法による皮膚の3次元培養を行うことから、購入するに足らない残額は次年度使用額としてそれらの培地・試薬類の購入に充てたほうが良いと判断した。
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