2018 Fiscal Year Research-status Report
糖尿病性腎症における特異的ポドサイト障害分子の同定と尿中バイオマーカーの樹立
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18K07415
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
櫻井 明子 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 助教 (70707900)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安部 秀斉 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 准教授 (60399342)
冨永 辰也 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 准教授 (80425446)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ポドサイト / バイオマーカー / 糖尿病性腎症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
慢性腎臓病(CKD)は全世界において拡大を続けている。中でも重症化するCKDの主たる原因は糖尿病性腎症であり、糖尿病性腎症によって新規に透析導入となる患者数は最も多い。現行の治療法では、腎不全への進展をわずかに遅延させるのみであり、他のCKDの原因と比較しても、予後は極めて不良である。また、診断の面では、アルブミン尿は腎症特異的でなく、糖尿病を合併する他の腎障害との鑑別は困難な状況にある。そのため、腎症発症・進行の分子レベルでの病態を明らかにし、診断法を明確なものとし、腎症に特異性の高く、有効な治療法を開発することは急務である。本研究では、podocyte lossが不可逆的な腎機能低下の原因であることに着目し、糖尿病における、ポドサイトの細胞恒常性の破綻がもたらされる機構を、ポドサイトの形質を制御する分子を中心に解析を進める。糖尿病による、ポドサイトの恒常性や形質の変化を経時的に解析することで、ポドサイトに特異的に発現する分子群の腎症における分子病態を統合的に理解し、腎症の病態・病期ごとに特異的な分子を抽出し、新たな診断のためのバイオマーカーの樹立と新規分子標的治療の探索を行う。バイオマーカーの樹立と新規標的分子の同定後、腎臓病の分子病態把握、治療の奏功性の評価、透析にいたる予後予測等の評価を行う。
糖尿病性腎症の特徴である糸球体硬化におけるポドサイト特異的分子群の制御機構の解明のため本年度実施した予備実験において、ヒト糖尿病性腎症の糸球体ポドサイトにおけるWT1の発現は正常の腎糸球体と比較して、明らかに発現量が減少していた。その変化は、ポドサイトにおいて正常で発現している特異的分子群（nephrin, podocin, CD2AP, podocalyxinなど）の発現低下を伴っていた。さらに、新たなポドサイト障害進展評価分子も見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
糖尿病性腎症の病理学的特徴である糸球体硬化におけるポドサイト特異的分子群の制御機構の解明のための予備実験において、ヒト糖尿病性腎症の糸球体ポドサイトにおけるWT1の発現は正常の腎糸球体と比較して、明らかに発現量が減少していた。その変化は、ポドサイトにおいて正常で発現している特異的分子群（nephrin, podocin, CD2AP, podocalyxinなど）の発現低下を伴っていた。ポドサイト特異的分子群の発現量の変化を経時的に解析し、糖尿病において、糸球体濾過機構の破綻する分子機序をポドサイト機能の低下という側面から解明を進めており、新たなポドサイト障害進展にcriticalな分子も見出している。分子診断パネル作成のため、糖尿病患者の尿・腎組織サンプルのバンクを用いた尿中バイオマーカー抽出法の樹立を行っている。腎生検により、確定診断の得られたバンク化済みの腎疾患患者尿サンプルを用いた、臨床データと分子病理所見のannotationが進行している。さらに、各分子の発現量は倫理委員会で承認され、同意書の得られた、健常者ならびに他のCKD患者尿との比較を行っている。また、糖尿病性腎症モデルマウスを用いてポドサイト特異的分子群の発現解析を行っている。経時的にアルブミン尿・血圧・体重・血糖等の測定と、後のバイオマーカー解析のために用いる血清および尿を採取している。
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| Strategy for Future Research Activity |
糖尿病における分子シグナルとポドサイト特異的分子群の制御機構の解明のために培養ヒトポドサイトを用いて、特異的に発現する分子群の網羅的な解析を行う。マイクロアレイ解析によって、糖尿病の進展とともに発現量の変化することを確認済みのポドサイト特異的分子と同調した発現変化を呈する遺伝子群を網羅的に同定する。これらを統合し、早期より病態へ関与している可能性の高い候補遺伝子に関して、ポドサイトにおけるタンパク質の発現の変化、細胞内での局在の変化を高血糖および正常血糖の両条件下で免疫細胞染色により確認し、Western blot法もしくは定量PCR法で有意性の評価を行う。培養ポドサイトを用いた検討の際に、細胞の回収時に培養液も回収し、障害を受けたポドサイト由来のエクソソーム、cell-free核酸の解析によって、バイオマーカーの候補分子を選定する。 糖尿病性腎症モデルによる病態を反映するポドサイト特異的分子群の機能解明のために前年度に取集したモデルマウスより腎を採取し、組織解析により、解析済みのバイオマーカー候補分子の機能を検討する。経時的に採取したマウスの腎組織において、腎糸球体内における制御分子、ポドサイト特異的分子群の存在・発現を病期の早期から各段階で、単離糸球体でのmRNA発現、免疫組織学的解析によるタンパク質発現を詳細に調べ、糖尿病におけるポドサイト障害の発症・進展に与える影響を明白にする。糖尿病患者の尿中ポドサイトマーカー測定ために、既にバンク化されている腎組織および尿サンプルを用いて、先に評価したexosome中タンパク質、exosome中核酸、cell-free DNAのうち、各ポドサイト特異的分子の測定に適した方法により定量を行い、各分子の患者腎組織中のポドサイト内発現量との相関関係を解析する。臨床情報、治療への反応性を調査し、病態特異的なバイオマーカーを選定する。
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| Causes of Carryover |
（理由）研究協力者に3月分の謝金支払いが完了していないため。
（計画）4月に支払いが完了する予定である。
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Research Products
(4 results)
