The development of the super high sensitive detection method not to be affected by the oxidation, a reduction material in a living body sample and the potential for expansion.

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K07450
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 外園 栄作 九州大学, 医学研究院, 講師 (60404042)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 高感度検出 / 錯体 / 過酸化水素 / 酸化 / 還元

Outline of Annual Research Achievements

生体成分の定量や酵素活性の測定は，病態を把握する上で臨床診断上不可欠である。生体成分分析領域である臨床化学分析では，迅速に結果を得ることが要求される上，目的成分の含有量も少なく，しかも試料採取量は微量であることが要求される。従って，生体成分の分析法を開発する上で，その方法は簡易・迅速かつ高感度であり，優れた特異性を有することが要求されている。
現在，臨床検査領域における生体試料分析には，数多くの酸化酵素が用いられ，生成した過酸化水素，4-Aminoantipyrine，トリンダー試薬をペルオキシダーゼ(POD)により酸化縮合させ生成物の呈色程度を利用して検出する方法が用いられている。そのため試料中の酸化・還元物質の影響を強く受け，特に尿を試料とする際には測定に大きな影響を受けるなどの問題がある。
本研究では従来の酸化還元反応による検出ではなく，直接，過酸化水素を定量する高感度測定系の構築を目指す。H2O2・金属・キレート錯体形成と界面活性剤による三次元錯体の発色を誘導することで現行のオキシダーゼ/ペルオキシダーゼ発色法よりもさらに高感度で特異性の高い新しい検出系の開発を試みる。そして，現行法とその性能，主にその測定感度や検出特異性を比較評価する事で，今後の臨床応用への可能性を探索・実証する事が本研究の目的である。
臨床検査における酵素測定法の約７割にペルオキシダーゼ検出技術が用いられている事を考慮すると本研究によるこの領域の検出技術革新がもたらすその効果は非常に大きい。また，臨床検査のみならず，本研究の波及領域は、免疫分析領域における標識２次抗体検出の高感度化、また、微量サンプルを用いる実験・研究等への応用が期待される。また、昨今の災害や緊急時における医療現場における感染症などの検査キットの検出への応用も十分に期待されると考えている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

感度の改善：昨年までの検討において課題であった感度についてわずかであるが感度が上昇し、良好な結果が得られた。
過酸化水素の安定性試験：外環境を賛成からアルカリの条件下で過酸化水素を添加し安定性について検証したところ、想定以上に安定であることが分かつた。
共存物質の影響試験：昨年までの水溶液ベースにおける検討結果をもとに生体試料成分（血清）を用いて検討を行った。結果、還元物質であるアスコルビン酸および尿酸による影響は血清ベースにおいても十分回避できることがわかった。しかしながら、感度を得るために緩衝液の条件を変更したため、血清中の蛋白成分が反応液に濁りを生じさせることがわかった。本年度の後半はこの回避について想定外の時間を費やすこととなった。種々、界面活性剤の添加を試みているが、本反応を満足させる界面活性剤の検索にはいまだ至っていない。そのため、当初予定していた、実際に酸化酵素を用いて本反応を検証する実験は未着手である。

Strategy for Future Research Activity

蛋白による影響回の為の検討：新たに課題となった蛋白の影響回について界面活性剤の検索を続ける。また、界面活性剤によらない別のアプローチによる回避法についても検討を進める。一方で、回避が困難と判断された場合は、予め蛋白を除去した後の本法の有効性についても検証を行う。
実酵素を用いた検証：実際に酸化系酵素を用いて反応溶液中において過酸化水素を生成したのちに、本反応がスムースに進行するか否かについても検証を行い、現行試薬と比較した際の有用性について検証を行っていく。

Causes of Carryover

本年度の検討において、新たな課題が生じたことから、当初予定していた酸化酵素関連を用いた検討に着手することができなかった。そのため、購入予定であった、酵素試薬関連費の支出が大幅に下回った。未着手のこの検討事項は、次年度の検討項目にいれて再度計画を立てており、当初より予定していた現行法との比較検討を含め、本法の有用性の検証を行うための費用と合わせて、改めて翌年度分の請求に組み入れたいと考えている。