Development of method for the determination of new antiepileptic drug concentration using monoclonal antibody

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K07487
• Research Institution: Nagasaki International University
• Principal Investigator: 大磯 茂 長崎国際大学, 薬学部, 教授 (40513106)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 仮屋薗 博子 長崎国際大学, 薬学部, 教授 (20437958) ; 森永 紀 第一薬科大学, 薬学部, 教授 (60465771)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 抗てんかん薬 / ラコサミド / モノクローナル抗体 / ナイロン膜

Outline of Annual Research Achievements

抗てんかん薬ラコサミドのアセチルアミノ基部位がアミノ基になっている(R)-2-Amino-N-benzyl-3-methoxypropionamide（ABMP）のアミノ基とスカシガイヘモシアニンKLHおよびヒト血清アルブミンのカルボキシ基を1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC）およびN-ヒドロキシスクシイミド（NHS）を用いて結合させて複合体を作製した。それらを、Balb/cマウスに免疫したところ、ABMP-KLHおよびABMP-HSA免疫マウス両方においてABMPに対する抗体価が上昇した。この抗血清による反応はラコサミドの添加により抑制が認められたことから、ラコサミドに対する抗体が生成していることが推察された。一方、ラコサミドとは別の分子（キャリア蛋白等）に対する高い抗体価上昇も確認された。ラコサミドに対する抗体価の上昇を数週間継続して確認した後、脾臓を摘出し細胞融合を試みたものの、ABMP-KLHおよびABMP-HSAのいずれの免疫マウスにおいてもモノクローナル抗体の単離精製には至らなかった。
一方、ナイロン膜を用いたドットブロットによる薬物濃度検出法の開発を当研究室において保有しているダビガトランモノクローナル抗体を用いて実施した。5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium（BCIP-NBT）による発色ならびに化学発光法による発色を利用した検出を試みたところ、50～500 ng/mL以下において良好な定量性が認められた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究課題で作製したい抗てんかん薬のモノクローナル抗体の単離精製に至っていないためやや遅れていると判断した。うまくいかない要因として、対象薬物以外の分子に対する抗体価上昇がみられ、分離がうまくできなかったことが挙げられる。複合体の生成効率が影響している可能性があり、別の手法を用いた複合体生成を試みる予定である。
一方、モノクローナル抗体を用いた簡易検出法の開発は進んでおり、抗体が作成できれば、それを用いた検出法の開発が速やかに進められる体制ができている。

Strategy for Future Research Activity

ラコサミドのモノクローナル抗体の作製は、キャリア蛋白との複合体生成が効率よく進んでいない可能性があるため、市販のKLH複合体生成キットを利用した複合体作製ならびに免疫を試みる。
低分子の抗てんかん薬ビガバトリンの抗体作製は、KLHとの複合体作成が終了しており、マウスへの免疫を進める。抗体価の上昇を調べ、抗体作製が認められたら細胞融合を実施する。
ペランパネルの抗体作製は合成反応のステップを要するため研究分担者と協力して進める。
ナイロン膜上でのドットブロットによる簡易検出法の開発は、これまでに単離精製している抗体を用いて検出を最適化できる条件の検討をすすめる。

Causes of Carryover

研究に必要な試薬や器材を購入した結果、若干の残余金が生じてしまった。次年度の研究実施にのための物品購入に利用する予定である。