Development of method for the determination of new antiepileptic drug concentration using monoclonal antibody

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K07487
• Research Institution: Nagasaki International University
• Principal Investigator: 大磯 茂 長崎国際大学, 薬学部, 教授 (40513106)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 仮屋薗 博子 長崎国際大学, 薬学部, 教授 (20437958) [Withdrawn] ; 森永 紀 第一薬科大学, 薬学部, 教授 (60465771)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: ラコサミド / モノクローナル抗体 / ナイロン膜 / ドットブロット

Outline of Annual Research Achievements

ラコサミドの抗体作製を実施した。はじめに、昨年度までの研究とは異なりMariculture keyhole limpet hemocyanin（mcKLH）を利用したKLHとの複合体作製キットを用いて反応させた反応物によりBalb/cマウス（Balb/cCrSlc）に免疫を行ったが、ラコサミドに対する抗体価上昇はみられなかった。免疫原となる(R)-2-Amino-N-benzyl-3-methoxypropionamide（ABMP）およびmcKLHとの複合体形成がうまくいっていないためと考えられた。以前に作製した免疫原では抗体価上昇がみられていたため、再度、同じ手法で免疫原を作製し、Balb/cマウスを他の研究で実績のあったBalb/cAJcl（日本クレア）に変更して抗体作製を試みた。その結果、ラコサミドに対する抗体価の上昇がみられたため、細胞融合を実施した。ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン（HAT）含有選択培地で培養してコロニーの生成が確認できたので、ELISA法により抗体価の確認を行ったものの吸光度の上昇がみられず、最終的にモノクローナル抗体を得ることはできなかった。
一方、濃度検出法の開発は、当研究室で保有している抗ダビガトランモノクローナル抗体等を用いて、ナイロン膜を用いたドットブロット法の基本的な測定プロトコールの確立を行った。ブロモクロロインドリルりん酸-ニトロブルーテトラゾリウム（BCIP-NBT）またはEnhanced Chemi Luminescence（ECL）を用いた検出法により濃度依存的な発色・発光の増減が得られ、臨床的に利用可能な濃度域での検量線作成が可能な測定方法を確立することができた。