2018 Fiscal Year Research-status Report
クローン病において制御性B細胞が機能低下に至る新規メカニズムの解明
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18K07971
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| Research Institution | Shimane University |
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Principal Investigator |
石原 俊治 島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 准教授 (80263531)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
三島 義之 島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 助教 (30397864)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | Crohn病 / 制御性B細胞 / アデノシン三リン酸 / 腸管免疫 / P2X7受容体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまで私共は、炎症を抑える制御性B細胞（Breg）の機能不全が腸炎を増悪すること、さらにクローン病（CD）ではその機能が有意に減弱していることを報告してきた。しかし、慢性炎症に関わるBregの機能低下がどのような機序で誘導されるのかは不明である。近年、 傷害組織で産生される細胞外アデノシン三リン酸（ATP）が、様々な炎症の病態に関わることが示唆されている。この細胞外ATPの機能は細胞種や病態によって多彩であるが、Bregへの関与の報告はない。私共は、ATP受容体が制御性免疫細胞に高発現しており、ATP依存性に炎症が増悪するという点に着目した。そして本研究においては「CDでは、細胞外ATPの持続刺激に依存してBregの機能低下を誘発するメカニズムが存在し、その結果として腸炎が増悪する」という仮説を検証する。本研究の成果によって、CDの新たな病態が明らかとなり、これまでと異なる視点からの診断法や治療法の開発に貢献できると考える。
現在は、「炎症粘膜局所で放出される細胞外ATPの持続暴露によってBregの機能が低下することを実験的に証明し、その象が腸炎増悪の原因になるかを検討すること」、さらに「CD患者だけでなく、潰瘍性大腸炎（UC）患者と健常部からの腸管B細胞を用いて比較検証することにより、ATP依存性の腸管Bregの機能減弱がCDに特異的な現象かを明らかにすること」を目的として、ヒトサンプルおよびマウス腸炎モデルの作成によって研究を実施している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究期間の前半は「細胞外ATPの持続刺激によるBregの機能低下機構」についての実験を進めている。代表者の石原は、研究全体の統括者としてマウス研究における実験方法と結果の評価について、分担者の三島と入念に協議した。初年度は、マウスモデルの作成を中心に実験をおこなった。特に、本研究で繁用する慢性腸炎モデル作成に関して、SCIDマウスとIL-10-KOマウスの購入、飼育、IL-10-KOマウスの繁殖などに時間を費やした。本モデルは、SCIDマウスにIL-10-KOマウスのT細胞を移入し作成するが、現在では慢性的に大腸に炎症を誘発するモデル作成が可能となっている。今後は、本モデルに野生型およびATP受容体であるP2X7の欠損マウスの腸間膜リンパ節から分離したB細胞を共移入し、腸炎の活動性の評価をおこなっていく。本実験では、B細胞におけるP2X7 発現の有無で腸炎の活動性が評価できることから、慢性腸炎において、ATPがBregの機能低下を介して腸炎が増悪する可能性を評価できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度に引き続いて、P2X7欠損マウスの実験を継続し、腸炎の病勢におけるBregの機能と細胞外ATPとの関連を明らかする。その後は、ATPがBregの機能低下を誘導するかを検討する。慢性炎症局所は持続的にATPに暴露された環境と想定し、in vitroにおいてATP処理した腸管B細胞にCpG DNAによるIL-10産生を誘導する培養系を作成する。これを用いて腸管B細胞のIL-10産生能とエフェクターT細胞のサイトカイン制御を指標としてBreg機能を評価する。 ① 手術標本のヒト健常部大腸粘膜から分離したB細胞を培養し、ATP処理した後にCpG DNAで誘導 されるIL-10をEIAとフローサイトメトリー（FCM）で解析しATP無処理群と比較する。 ② 野生型（WT）およびP2X7欠損（KO）マウス（購入）の腸間膜リンパ節（MLN）から分離培養したB細胞をATP処理し①と同様に解析する。 ③ ②と同様にATP処理したB細胞をWTマウスMLN から分離した腸管CD4+ T細胞と共培養し、CD3/CD28で刺激後に上清中IFNγおよびIL-17を測定し、ATP無処理群と比較する。（①～③の前に各種B細胞におけるP2X7発現とIL-10発現の相関をFCMで確認しておく）＊①～③の結果から、腸炎時には、細胞外ATPがP2X7を介してBregの機能を抑制することによりエフェクターT細胞が抑えきれないという現象が検証可能である。
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| Causes of Carryover |
平成３０年度は、本研究で用いる慢性腸炎モデル作成に関して、SCIDマウスとIL-10-KOマウスの購入、飼育、IL-10-KOマウスの繁殖などに時間を費やした。しかしながら、IL-10-KOマウスの繁殖が当初の計画通りに進まず、慢性腸炎モデルの樹立がやや遅れた。その結果として、ヒトサンプルを用いた実験、in vitroでの実験の施行に至らず、購入する予定であった細胞分離や培養系に用いる試薬、各種抗体などに使用予定としていた実験費用を次年度へ繰り越すこととなった。
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[Journal Article] Capabilities of fecal calprotectin and blood biomarkers as surrogate endoscopic markers according to ulcerative colitis disease type2019
Author(s)
Sonoyama H, Kawashima K, Ishihara S, Kotani S, Fukuba N, Oka A, Kusunoki R, Tada Y, Mishima Y, Oshima N, Moriyama I, Yuki T, Onishi K, Kinoshita Y
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Journal Title
J Clin Biochem Nutr
Volume: in press
Pages: in press
Peer Reviewed
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