2018 Fiscal Year Research-status Report
Ptotective effect of xanthine derivatives on colitis-associated dysplasia
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18K07987
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
溝口 恵美子 久留米大学, 医学部, 准教授 (40782157)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 炎症性腸疾患 / キサンチン誘導体 / CHI3L1 / 慢性炎症関連性大腸炎 / 上皮異形成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
炎症性腸疾患における慢性炎症からの癌化にキチナーゼ３様タンパク1型(CHI3L1)が深く関与していることが知られている。また、我々はキサンチン誘導体の一種であるカフェイン（CAF）がCHI3L1の活性を抑制することを確認していることから、CAF以外のキサンチン誘導体であるペントキシフィリン（PTXN）またはテオフィリン(THEO)とCAFを組み合わせ投与することでより効果的に慢性炎症からの癌化を抑制できるかどうかの検討を行っている。平成30年度では、1) 3種類のヒト大腸上皮細胞株を用いてCAFとPTXNの単剤または組み合わせ投与による細胞毒性をMTTアッセイで確認したところ、組み合わせ投与による細胞毒性は認められなかった。THEOはHCLのみに可溶性のため本実験から除外した。2) 次にHCT116細胞をTNF刺激下に48時間マトリゲル基底膜マトリックスで3次元培養したところ、刺激前に核周辺・細胞質に局在していたCHI3L1が、刺激後は上皮異形成で見られるように核内に移行していた。この核内移行はCAF（2.5ｍM）またはPTXN (100mM)単剤では不完全に、CAF（2.5ｍM)+PTXN (100mM)併用では、ほぼ完全に抑制された。このことからCHI3L1の核内移行が炎症下での上皮異形成に重要である可能性が強く示唆された。3) 次にマウス慢性炎症からの癌化モデルとして、Azoxymethane（AOM）と3.5%デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を用いたが、第3サイクルDSS下での体重減少が著しく（＞２０％）実験を中断した。次回実験ではDSS濃度を２～２.5%に下げるか、またはAOMのみを6回腹腔内投与する実験系に変更する予定である(本学動物実験計画書は承認済み)。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1) CAFとPTXNとの併用によって、大腸上皮細胞に対する毒性がないことが確認できた。2)慢性炎症状態と深く関与するサイトカインであるTNF刺激によってCHI3L1が核内に移行すが、CAFとPTXNの組み合わせ投与によってCHI3L1の核内移行が阻止された。慢性炎症からの上皮異形成にCHI3L1の核内移行が関与している可能性がありCHI3L1内のNuclear Localization Sequence (NLS)が重要な意味を持つことが示唆され、キサンチン誘導体の組み合わせ投与の重要性がクローズアップされてきた。3) 現在、本大学の新動物実験室における適切なDSS濃度を検証中だが、2～2.5%程度の濃度に変えることによって予定範囲内での体重減少（<15%）に抑え得ることが予測できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
1) CRISPR/CAS9システムの準備が整ったため、内因性のCHI3L1のエクソン３-6を欠損、またはNLSのみを欠損させたHCT116細胞株を樹立することでCHI3L1およびCHI3L1内NLSの機能を検討する。更にｐｃDNA3.1 human CHI3L1プラスミド（作成済み）をトランスフェクションして3次元培養下でCHI3L1を過剰発現させたヒト大腸癌細胞株をTNFやその他の炎症性サイトカイン（e.g., IL-1、IL-6）で刺激することでCHI3L1の核内移行の有無を確認する。2) AOMと2.5%DSSの3サイクル投与によるマウス慢性腸炎を用いて、ｄH2Oのみ、CAFのみ、PTXNのみ、CAFとPTXNの両方を予防的に経口または注腸することで、腸炎の重症度と異形成化を抑制できるかどうかを確認する。また、AOMを1週間おきに6回注腸投与することによって大腸（特に直腸）特異的に異形成を起こすモデルを用いて、キサンチン誘導体の組み合わせ投与の効果を検討する。
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