2018 Fiscal Year Research-status Report
細胞内結晶化ならびに可溶性尿酸による心房筋炎症と心房細動の発症機構とその制御方法
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18K08074
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
李 佩俐 鳥取大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40464292)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
久留 一郎 鳥取大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60211504)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | Kv1.5 / NLRP3 inflammsome / gout / monosodium urate |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）可溶性尿酸（ uric acid- UA）と不溶性尿酸結晶 ( monosodium urate- MSU)はNLRP3 インフラマソームに及ぼす影響の検討。
マウスマクロファージ (J774.1) にE. coli lipopolysaccharide (LPS)５時間又UAおよびMSU５時間を添加後、ウエスタンブロット法で培養液に分泌されるカスペーゼ 1とIL-1βを解析した。NLRP3 インフラマソームを活性化することで不活性型前駆体カスペーゼ-1が切断され、活性型カスペーゼ 1(p20) が形成される。活性化カスペーゼ 1は活性化型IL-1βの生産を増強し、活性型カスペーゼ1とIL-1βを細胞外に分泌される。LPSおよびMSUの添加は細胞培養液で活性型カスペーゼ1 p20を検出され、活性化型IL-1βを増強させた。NLRP3 インフラマソームの活性化を示唆した。一方LPS単独又LPSおよび可溶性UAの添加はNLRP3 インフラマソーム 活性化に影響を及ぼさないことが明らかになった。
２）K チャネルはNLRP3インフラマソーム活性化に及ぼす影響の検討
ウエスタンブロットと免疫染色を用いて、KチャネルKv1.5 蛋白のJ774.1での発現が確認された。NLRP3 インフラマソーム 特異阻害剤MCC950はJ774.1のLPSおよびMSUによる活性型カスペーゼ1と活性型IL-1βの分泌を抑制した。Kチャネル阻害剤4-aminopyridine (4-AP) の添加はMCCと同様に NLRP3 インフラマソーム の活性化を抑制した。Kv1.5特異阻害剤Diphenyl phosphine oxide-1(DPO-1) の添加 はNLRP3インフラマソーム の活性化を著しく抑制し、その抑制は容量依存性的であった。siRNAによるKv1.5のノックダウンはNLRP3インフラマソーム活性化を抑制することを確認した。一方、Kv1.3チャネルのmRNAはJ774.1に発現していたが、Kv1.3特異阻害剤PAP-1の添加又siRNAによるKv1.3のノックダウンはNLRP3インフラマソーム 活性化に影響を及ぼすことはなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初尿酸によるインフラマソームにおよび影響はHL-1心筋細胞を用いて検討する予定であったが、マウスマクロファージを用いた研究に変更することで、順調にデータを得ることができた。これまでにマクロファージのＫチャネルが尿酸結晶によるインフラマソームの活性を制御することは報告されていないために、本機構を解明することは学問的な重要性のみならず新しい治療方法の開発にも有意である。
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| Strategy for Future Research Activity |
１)Kv1.5 over-expressionによるNLRP3インフラマソーム活性に及ぼす影響、ウエスタンブロットやELISAによる検討する。２)ELISAを用いて、Kv1.5及びKv1.3特異阻害剤によるIL-1βに及ぼす影響を確認する。３)Kv1.3チェネル蛋白の発現はウエスタンブロット法、又チャネル機能はpatch clamp法を用いて、Kv1.5 とKv1.3はNLRP3インフラマソーム活性に影響の違い原因を探る。４)Kv1.5はNLRP3インフラマソーム活性化に及ぼす影響のメカニズムを検討する。Kv1.5チャネル特異阻害剤やKv1.5 overexpressionはASCおよびNLRP3の oligomerizationに及ぶ影響を検討する。５)Human マクロファージを用いて、Kv1.5はNLRP3インフラマソーム活性化に及ぼす影響を確認する。６)マウスやラットモデルを用いて、Kv1.5阻害剤は尿酸結晶によるNLRP3インフラマソーム 活性に及ぼす影響を検討する。
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| Causes of Carryover |
Kv1.5チャネルがNLRP3インフラマソームを制御するメカニズムを明らかにするために、transfection, ノックダウン実験、ASCおよびNLRP3 oligomerization実験など計画しているために、ウエスタンブロットと免疫染色用抗体、ELISA kit、transfection 要試薬、細胞培養試薬などの消耗品を購入する必要がある。
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