メカノシグナルによる心筋微小管の動的制御機構の解明と治療への応用

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K08105
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 新谷 泰範 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (20712243)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 塚本 蔵 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (80589151)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: AMPK / 微小管

Outline of Annual Research Achievements

AMPKが心臓において介在板に局在することを見出し、介在板におけるAMPKの基質の探索をおこない、複数の新規基質を同定した。興味深い新規分子に対してリン酸化部位の同定、およびリン酸化特異的抗体の作成に成功した。
心拍動を停止する薬剤処理により、細胞膜におけるAMPK活性の低下、それが局在の可逆的な変化によるものであることを見出した。
細胞膜に局在するPM-ABCARを発現するTGラットをゲノム編集により作成し、このTGラット心臓より成熟心筋細胞を単離し、細胞膜へのPM-ABKARの発現を確認した。浮遊した状態で細胞接着が保たれたpaired cellsを選別し、ガラスピペットで進展刺激を加える実験系の構築を目指し、進展刺激を加える条件を検討中である。
AMPKによるリン酸化の役割を生体で検討するために、CLIP-170のリン酸化部位に変異を加えた S311A,あるいはWT をloxPではさんだコンストラクトを、タモキシフェン誘導下で心筋特異的に発現するトランスジェニックマウスを作成。S311A　TGマウスは、有意な線維化と心収縮力の低下を認めた。さらにドキソルビシン負荷心不全モデルを作成したところ、S311A　TGマウスではコントロールに比べさらなる心機能の悪化を認めた。電子顕微鏡による観察において、介在板の構造異常が観察された。リン酸化を模倣するS311D　TGマウスも作成し、タモキシフェン誘導下での心機能を検討したが、S311Aとは対照的に、有意な変化を認めなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

計画通りに進展している

Strategy for Future Research Activity

PM-ABCARを発現するTGラットから単離したpaired cell に対して進展刺激による、細胞接着部のAMPK活性の変化を検討する。またトランスジェニックマウスについてはS311Aミュータントが安静時において心機能に有意な差をみとめており、今後心電図、ジャンクション分子の免疫組織染色によりさらに詳細な解析を行う予定である。またリン酸化を模倣するS311D　TGマウスも作成し、タモキシフェン誘導下、および病態モデルでの解析を行う予定としている。

Causes of Carryover

PM-ABKARトランスジェニックラット作成が予定通り進行し、単離心筋のひっぱり実験に予定していた予備実験がすくなくすみ、また試薬も安く購入できたため差額が生じた。次年度は心筋培養系の実験、およびトランスジェニックラット、マウスを用いた実験も当初の予定より検討する条件数を増やし、より詳細な検討をくわえていく。また成果の発表のタイミングが次年度のほうが適しており、学会出張を控えたため、旅費が当初の予定より少なかった。次年度に学会出張を計画している。