The roles of two isoforms of fructokinase on diabetic kidney disease

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K08238
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 石本 卓嗣 名古屋大学, 医学部附属病院, 講師 (00534835)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 丸山 彰一 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (10362253)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: KHK-C KOマウス / CRISPR/Cas9 / マウスKHK-C強制発現細胞株

Outline of Annual Research Achievements

糖尿病性腎臓病(diabetic kidney disease, DKD）の進展における２つのフルクトース代謝酵素ケトヘキソキナーゼAとC（KHK-A・KHK-C）の役割を解析する。
1) KHK-A KO・KHK-C KO・KHK-A/C KOマウスを用いた検討
既にKHK-A KO・KHK-A/C KOマウスは保有しており、KHK-C KOマウスの作成をCRISPR/Cas9システムを用いて作成中である。1本のｇRNAおよび２本のｇRNAを用いでマウスKHK-Cを欠損する遺伝子改変マウスを作成し、それぞれから複数のlineを取得。現在、コロニーを拡大し、offspringを用いたoff targetについての解析を進めている。
2) マウスKHK-C antisenseの作成し、DKDに対する治療効果を検討する
KHK-A・KHK-Cはexon3のsplicing variantであり、それぞれexon3a・exon3cを有することから、exon3cを標的としたマウスKHK-C antisenseの候補配列を構造解析も行いつつ複数決定した。KHK-Cは生体内においては腎の近位尿細管に高発現するが、不死化細胞および初代培養細胞においてはその発現が低下することから、マウスKHK-C antisenseのKHK-C発現抑制効果の確認のため、マウスKHK-C・マウスKHK-Aを強制発現するHK-2細胞株を樹立した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

CRISPR/Cas9システムを用いたKHK-Cを欠損する遺伝子改変マウスは、複数のlineが樹立できており、そのoffspringも得られている。またoff targetの解析も終了しつつある。
また、マウスKHK-C・マウスKHK-Aを強制発現するHK-2細胞株の樹立、マウスKHK-Cを標的とするantisenseの候補配列も決定・合成も終了している。

Strategy for Future Research Activity

１）　CRISPR/Cas9システムを用いたKHK-Cを欠損する遺伝子改変マウスのoff targetの解析をさらに進める。終了後、ストレプトゾトシンを用いたI型糖尿病モデルを作成し、KHK-C KOマウスにおけるDKDの進展抑制作用について解析する。
２）　KHKーC強制発現培養細胞を用い、antisenseによるKHK-C発現抑制効果を検討し、抑制効果の高い配列を選択する。その後、安定化修飾したKHK-C antisenseを用いてin vivoにて検討する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Renal Diseases and Hypertension/University of Colorado Denver(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: Renal Diseases and Hypertension/University of Colorado Denver
• [Journal Article] Lacking Ketohexokinase-A Exacerbates Renal Injury in Streptozotocin-induced Diabetic Mice. (2018)
  • Author(s): Tomohito Doke, Takuji Ishimoto, Takahiro Hayasaki, Satsuki Ikeda, Masako Hasebe, Akiyoshi Hirayama, Tomoyoshi Soga, Noritoshi Kato, Tomoki Kosugi, Naotake Tsuboi, Miguel A. Lanaspa, Richard J. Johnson, Kenji Kadomatsu, and Shoichi Maruyama
  • Journal Title: Metabolism Volume: 85 Pages: 161-170
  • DOI: 10.1016/j.metabol.2018.03.020
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] Renal phospholipid accumulation in high-fat diet fed streptozotocin induced diabetic mice depends on ketohexokinase (2018)
  • Author(s): Tomohito Doke, Takuji Ishimoto, Takahiro Hayasaki, Richard J Johnson, and Shoichi Maruyama
  • Organizer: American Society of Nephrology, Kidney week
  • Int'l Joint Research