気道・肺の障害・修復と再生におけるp53の役割～p53遺伝子改変ブタを用いた研究

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K08785
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 鳥羽 博明 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 助教 (40403745)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川上 行奎 徳島大学, 病院, 特任講師 (00596249) ; 河北 直也 徳島大学, 病院, 特任助教 (60522266) ; 森本 雅美 徳島大学, 病院, 特任助教 (90563817) [Withdrawn] ; 谷原 史倫 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 特任助教 (90754680) ; 平田 真樹 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 特任講師 (10815583)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 急性肺障害 / 肺の修復・再生 / p53遺伝子改変ブタ / 肺オルガノイド

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は，p53がブタ肺の急性気道・肺胞上皮の障害・再生にどのような役割を果たすかどうかについて明らかにすることである．野生型ブタのLipopolysaccharide (LPS)誘導急性肺障害モデルの作成の症例を重ね、計5症例に行った。全身麻酔で気管支鏡下にLPS1㎎/kgを右前葉に選択的に投与し，コントロールとして左前葉に選択的にPBSのみ同量を注入した．投与直前・2時間後・6時間後・48時間後をタイムポイントとして，CT撮像，気管支肺胞洗浄液（BAL）・血清・肺組織を採取した．結果，CTでは2時間後すでにLPSを投与した右前葉には浸潤影が出現し，48時間後にはconsolidationを呈していた．組織学的にも，炎症細胞の浸潤とともに肺胞壁の著明な浮腫を伴っていることを確認した．これらは全例同様で，再現性をもってLPS誘導急性肺障害モデルを作成することができた，肺乾湿比，BAL中細胞数もコントロール群と比べて有意に増加しており，急性肺障害を示唆する所見であった．加えて，気道上皮障害モデルとして，polidocanol(PDOC)誘導気道上皮障害モデルについても野生型ブタに対して行った．H-E染色では一部に気道上皮障害を認めた．いずれのモデルに関してもp53 KOブタへの投与は終了していないが，preliminaryな結果を得ており，今後は症例を重ねていく予定である．今年度はさらにブタ肺からのオルガノイド作成にも着手した．まず野生型ブタの気管～気管支を採取した後，コラゲナーゼ処理で気道上皮のみを得て，基底細胞マーカー（p63+/ITGA6+）によるFACS解析を行った．陽性細胞を回収することはできたが，現時点では安定的に細胞量を確保できるまでには至っていない．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

p53ノックアウトブタの作成が難しいことが最も大きな要因である．これまでノックアウトブタ作成を数回トライしたが，安定的にp53ノックアウトブタを使用できる状況に現時点ではない．p53ノックアウトブタは妊娠後～使用できるまでには数か月間を要する．しかしながら，現時点でLPSやPDOCによる気道肺障害モデルの作成は確立できているため，P53ノックアウトブタが確保でき次第，実験を進めることは可能である．ブタ肺からのオルガノイド作成に関してもFACSによるソーティングの結果にまだばらつきがある．

Strategy for Future Research Activity

コラボレーション相手である当大学生物資源産業学部の共同研究者と緊密に意見交換し，定期的にカンファレンスを行っている．現在，p53ノックアウトブタの作成をより進めてもらっており，使用可能になり次第，速やかにLPS・PDOCモデルを作成し検討する予定である．ブタ肺オルガノイド作成については，プロトコールを微調整しながら，最も良い条件設定を模索している．特に培養液と増殖因子が重要と考えられるため，量と種類を工夫しながら進めていく予定である．

Causes of Carryover

未施行のMicro array用のキット・外注費やサイトカイン・ケモカイン測定用のキット・外注費に加えて，高額な抗体や分化促進因子が未購入であることが未使用額として生じたと考えている．上記に示したように，残額は特にMicro arrayやケモカイン・サイトカイン測定の外注費に主に充てたいと考えている．