気道・肺の障害・修復と再生におけるp53の役割～p53遺伝子改変ブタを用いた研究

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K08785
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 鳥羽 博明 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 准教授 (40403745)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川上 行奎 徳島大学, 病院, 特任講師 (00596249) ; 河北 直也 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 助教 (60522266) ; 森本 雅美 徳島大学, 病院, 特任助教 (90563817) [Withdrawn] ; 谷原 史倫 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 特任助教 (90754680) ; 平田 真樹 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 講師 (10815583)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 急性肺障害 / 肺の修復・再生 / p53遺伝子改変ブタ / 肺オルガノイド

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は，p53がブタ肺の急性気道・肺胞上皮の障害・再生にどのような役割を果たすかどうかについて明らかにすることである．すでに計5症例において野生型ブタのLipopolysaccharide (LPS)誘導急性肺障害モデルの作成は終了しているが，今年度はp53 KOブタを用いて行った（n=3）．方法は，野生型ブタと同様，全身麻酔で気管支鏡下にLPS1㎎/kgを右前葉に選択的に投与し，コントロールとして左前葉に選択的にPBSのみ同量を注入した．投与直前・2時間後・6時間後・48時間後をタイムポイントとして，バイタルサイン，CT撮像，気管支肺胞洗浄液（BAL）・血清・肺組織を採取した．野生型ブタ同様，CTでは2時間後すでにLPSを投与した右前葉には浸潤影が出現し，48時間後にはconsolidationを呈していた．加えて，6時間後のバイタルサインでは有意にp53 KOブタにて脈拍の低下を呈した．左前葉のコントロール群と比較肺乾湿比，BAL中細胞数もコントロール群と比べて有意に増加していた．また，組織学的にも，急性肺障害を呈していることを確認することができた．加えて，血清・BALサンプルを用いて，いくつかのサイトカイン測定（TNF-α，IL-6，IL-10）を行い，6時間後のサンプルでp53 KOブタにおいて有意に上昇していることを確認した．昨年度に引き続き，ブタ肺からのオルガノイド作成も試みた．野生型ブタの気管～気管支を採取して，再現性をもって基底細胞マーカー（p63+/ITGA6+）陽性細胞を安定的に回収することはできるようになった．3.0×104/mlに調整し，differentiation medium内で3D培養し，経時的に観察し，14日間培養したところ，Organoid様構造物を昨年度よりも安定的に構築できるようになった．ただ，各種マーカーの免疫染色において，気道上皮細胞への分化が確認できる段階には至っておらず，プロトコールの見直しなどを行っている途中である．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

p53ノックアウトブタの作成が難しいことが最も大きな要因である．これまでノックアウトブタ作成を数回トライしたが，安定的にp53ノックアウトブタを使用できる状況に現時点ではない．p53ノックアウトブタは妊娠後～使用できるまでには数か月間を要する．十分なP53ノックアウトブタが確保した後，オルガノイド作成の継続とプロトコールの見直しを含めて継続して進めていく予定である．

Strategy for Future Research Activity

コラボレーション相手である生物資源産業学部の研究分担者と緊密に意見交換し，定期的にカンファレンスを行っている．現在，p53ノックアウトブタの作成を進めてもらっており，作成でき次第，PDOCモデル作成を行う予定である．ブタ肺オルガノイド作成については，安定的に幹細胞と思われる基底細胞マーカー陽性細胞は得ることができ，オルガノイド様構造物を確認できており，プロトコールを微調整することで実験を進めていきたいと考えている．

Causes of Carryover

未施行のMicro array用のキット・外注費やサイトカイン・ケモカイン測定用のキット・外注費に加えて，高額な抗体や分化促進因子が未購入であること，p53 KOブタ作製用費用分（シークエンス等）として確保していたことで未使用額として生じた．翌年度分として請求した研究費と合わせて，Micro arrayやケモカイン・サイトカイン測定の外注費に充てることに加えて，p53ノックアウトブタの確保のために使用する予定である．