2018 Fiscal Year Research-status Report
吸入麻酔薬の心保護作用に対するオートファジー・ミトコンドリアダイナミックスの影響
| Project/Area Number |
18K08817
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokushima |
|---|
Principal Investigator |
酒井 陽子 徳島大学, 病院, 特任准教授 (90711862)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
角田 奈美 徳島大学, 病院, 講師 (00622606)
田中 克哉 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 教授 (30263841)
堤 保夫 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 准教授 (90523499)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | 吸入麻酔薬 / プレコンディショニング / オートファジー |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
マウスを人工呼吸下に開胸、血行動態を測定しながら、心臓冠動脈を30分間閉塞した後、2時間再潅流し、再び冠動脈を閉塞、Evans Blueを注入し心臓を取り出した。心臓をスライスし、TTCにて再染色を行い心筋梗塞サイズを測定した。
コントロール群、吸入麻酔薬（イソフルラン1.0 MAC）群、オートファジー誘導剤（ラパマイシン）群、オートファジー抑制剤（3-メチルアデニン: 3-MA）群において心筋梗塞サイズを測定比較した結果、吸入麻酔薬群においてはコントロール群と比較して心筋梗塞サイズが減少した。このことは以前から報告のある、吸入麻酔薬のプレコンディショニング作用を示すものとして相違はなかった。
また、オートファジー誘導群においては吸入麻酔薬群と同等の心筋梗塞サイズの減少を認めた。オートファジー抑制群では心筋梗塞サイズの減少は認めず、コントロール群同様、心筋保護効果がないことが明らかとなった。
次に、吸入麻酔薬イソフルランにオートファジー抑制剤（3-メチルアデニン: 3-MA）を加えた群、およびオートファジー誘導剤（ラパマイシン）にオートファジー抑制剤（3-メチルアデニン: 3-MA）を加えた群について虚血再灌流後の心筋梗塞サイズを測定した。その結果、両群ともに心筋梗塞サイズの減少は認められず、オートファジー抑制剤（3-メチルアデニン: 3-MA）によって、吸入麻酔薬やオートファジー誘導剤の心筋保護効果が棄却されることが明らかになった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請書に記載した研究目的に対し、平成30年度の進捗度合いは同じであり、おおむね順調と思われる。また、現在イムノブロットによる研究を進行中であり、さらには、研究協力者である海外の研究者ともやり取りを行い、研究の進め方についてディスカッションを進めている。
これらによって本研究期間内に、吸入麻酔薬の心筋保護作用経路におけるオートファジー・ミトコンドリアダイナミックスの果たす役割が解明されることが期待される。
|
| Strategy for Future Research Activity |
研究実績の概要に記載した各群について、各群のマウスの摘出心を組織固定し、オートファジーの誘導を単位面積当たりのオートファゴソームを電子顕微鏡にて観察、アッセイキットにて検出し比較検討する。また、関連タンパクについてイムノブロッティング法にて比較する（LC3-I/LC3-II、Beclin1など）。
また、摘出心をランゲンドルフ酵素法を用い得られた遊離心室筋細に対し、1 時間低酸素状況に暴露することで心室筋細胞に虚血状態をつくりだす。その後通常の培養状態に戻すことで再潅流状態とする。ミトコンドリア染色色素（MitoTracker）、光褪色後蛍光回復法（FRAP assay）を用いて各群のミトコンドリアダイナミクス（ミトコンドリアの分裂と融合）を明らかにする。また、ミトコンドリア膜電位を蛍光検出し、プレコンディショニング作用が与える影響について考察を加える。さらに、オートファジー及びミトコンドリアの分裂・融合タンパクについてイムノブロット・real-time PCRを用いて調べる。また、各群の心臓をホモジナイズし、密度勾配遠心法にてミトコンドリア分画を得た後、ミトコンドリア膨化アッセイにより吸光度の変化によってCa2+依存性ミトコンドリア膨化がAPC刺激による心筋保護効果にどのように影響するかを調べる。さらにこの影響を可視化するため、calsein-AM試薬を用いて細胞を蛍光ラベルし、mPTP開閉を観察する。
|
| Causes of Carryover |
（理由）平成30年度3月納品となり、支払いが完了していないため、次年度使用額が生じた。
（使用計画）
平成31年度に支払予定である。
|
