2018 Fiscal Year Research-status Report
造精機能障害に対するエピゲノム創薬を目指したヒストン修飾酵素Kdm5aの機能解析
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18K09202
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
西尾 英紀 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 助教 (10621063)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安井 孝周 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (40326153)
林 祐太郎 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (40238134)
水野 健太郎 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (70448710)
神沢 英幸 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 研究員 (00551277)
守時 良演 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 研究員 (50595395)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ヒストン修飾 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Kdm5a強制発現ベクターを作成し、マウス精原細胞培養株であるGC-1細胞にKdm5aを遺伝子導入した。そして、Kdm5aに制御される遺伝子の網羅的な探索のため、Kdm5aを遺伝子導入したGC-1細胞を用いてマイクロアレイ解析を行った。その候補遺伝子の中でエピジェネティックに発現制御される遺伝子に着目し、それらの遺伝子のKdm5aによるメチル化状態の変化について、ヒストンH3K4抗体を用いてChIP-qPCR assayで検討した。さらに、ヒト停留精巣と下降精巣の精巣組織を用いて、定量RT-PCRによるKDM5Aおよび精細胞分化の関連遺伝子（ESR1, ESR2, GDNF, GFRA1, KIT, KLF4, MYC, NANOG, PGR, POU5F1, RET, THY1）の発現について検討した。またヒト停留精巣の組織を用いて、KDM5Aの発現局在と、ヒストンH3K4のメチル化状態について二重免疫染色を用いて検討した。マイクロアレイ解析では、Kdm5a強発現により、Tet1 (Fold change; FC =19.4)、Btc (FC=19.4)、Scml2 (FC=16.4)が発現亢進し、Wnt1 (FC=108.2)、Sox6 (FC=26.7)、Sox8 (FC=26.4)遺伝子の発現低下を認めた。ChIP-qPCR assayで、GC-1細胞においてKdm5aを強制発現しても、Tet1遺伝子のメチル化状態の変化を認めなったが、Scml2については、H3K4me3で発現亢進を認めた。ヒト停留精巣では、KDM5Aの発現（1.54倍）が亢進し、また精細胞分化の関連遺伝子であるESR2の発現（1.50倍）も亢進していた（p＜0.05）。蛍光免疫染色では、ヒト停留精巣組織において、KDM5Aが発現亢進している細胞ではH3K4me2（ジメチル）およびH3K4me3（トリメチル）の発現が低下し、H3K4me1（モノメチル）の発現が亢進していた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
In vitroにおけるKdm5aの機能解析では、精子幹細胞の初代培養を確立することが困難のため、精原細胞の培養株であるGC-1細胞を使用している。また次世代シーケンサーの手技の準備に時間がかかっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ChIP assayを用いて次世代シーケンサーによる解析を行った上で、In vivoにおけるKdm5aの機能解析を予定している。
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