2018 Fiscal Year Research-status Report

MALT1核移行メカニズムと口腔癌細胞浸潤

Research Project

Project/Area Number	18K09542
Research Institution	The Nippon Dental University
Principal Investigator	今井一志日本歯科大学, 生命歯学部, 教授 (10328859)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	冨山希美 (美原希美) 日本歯科大学, 生命歯学部, 助教 (00803264) 千葉忠成日本歯科大学, 生命歯学部, 准教授 (60350138)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	口腔癌 / MALT1 / ドメイン
Outline of Annual Research Achievements	Mucosa associated lymphoid tissue lymphoma translocation gene 1（MALT1）はリンパ球系細胞ではNF-κBシグナル伝達分子として機能し、口腔癌細胞では核に局在するとともにMAPKシグナルの抑制に働く。予後が不良な口腔癌組織では高頻度に発現が停止し、口腔癌細胞はMALT1の発現停止とともに高度悪性形質（増殖能、浸潤能、遊走能、等）を著しく増強する。このように、リンパ球系細胞と口腔癌細胞ではMALT1の局在と作用機転が大きく異なるが、その分子的な背景は全く不明である。本研究では、両細胞系列で最も顕著な違いといえる細胞内局在について着目し、口腔癌細胞におけるMALT1核局在の分子メカニズムに焦点を当てて解析を行っている。MALT1の各種ドメインを様々な組合せで欠失させた12種類の変異体を作製後、口腔癌細胞株に恒常的あるいは一過性に導入し、ウエスタンブロットおよび蛍光免疫染色で核局在に必要なドメインを解析した。その結果、カスパーゼ様ドメインをふくむ全てのコンストラクが核に局在し、それを含まないコンストラクトは細胞質に認められた。以上の結果から、口腔癌細胞のMALT1の核局在にはカスパーゼ様ドメインが責任ドメインとして働くことが明らかになった。現在は、核移行の更に詳細なメカニズムと癌細胞の増殖抑制作用との関連について引き続き検討を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason MALT1を構成する4つの機能ドメインを様々な組合せで欠失するcDNAコンストラクトをPCRで作製し塩基配列を確認後、４種類の口腔癌細胞株（HSC2、Ca9.22、SCCKNおよびTSU）に一過性に導入した。細胞を核画分と細胞質画分に分離後、それぞれのコンストラクトの両画分における発現をウエスタンブロットで検討した。その結果、C末端側に位置するカスパーゼ様ドメインをふくむコンストラクのみが核画分に検出され、他のドメインに依存する核局在は認められなかった。上記の結果を反映する５種類の代表的コンストラクトを恒常的に発現する口腔癌細胞株（HSC2）を樹立し、同様に細胞内局在を検討した。ウエスタンブロットと共焦点レーザー顕微鏡を用いた免疫細胞染色で解析したところ、MALT1はカスパーゼ様ドメイン依存性に核に局在することが示された。また、リンパ球系細胞では、内在性MALT1は細胞質に発現することを確認した。核に局在するタンパクの多くは核以降シグナル（NLS）をもつことが多い。しかし、MALT1カスパーゼ様ドメインには明確なNLS配列がなく、他のメカニズムによってコントロールされている可能性が高い。そこで、タンパク質の核内移行を誘導することが知られているThr-Tyr-Glu（TEY）配列に着目した。カスパーゼ様ドメインに存在するTEY配列について検討するため、そのAla変異体を作製・導入して細胞内局在を解析した。しかし、Ala変異体の細胞内局在には変化がみられなかったことから、他のメカニズムによってMALT1核局在が決定されると予想される。現在、メカニズムについて検討中である。 MALT1の発現喪失によって増強される代表的な口腔癌細胞高度悪性形質に細胞増殖能が挙げられる。これまでに興味深いデータを得ており、今後の解析により、その詳細を明らかにする予定でいる。
Strategy for Future Research Activity	これまでの研究により、MALT1のリンパ球系細胞と口腔癌細胞での挙動には根本的な相違点が存在すると予想される。そのためには、口腔癌細胞における核局在メカニズムの詳細を明確にし、MALT1の分子挙動に果たす意義を追求していく必要がある。タンパク質の核移行に働きえるSUMO化について検討する。カスパーゼ様ドメインに存在する２か所のSUMO化標的部位のアミノ酸配列に変異を導入したcDNAを口腔癌細胞株に導入し、細胞内での局在をウエスタンブロットと蛍光免疫染色で検討する。細胞質に局在する場合は、SUMO化の存在を実証するとともに、SUMO化阻害剤等を用いて核移行との関連を詳細に検討する。SUMO化がみられない、あるいは核局在と関係しない場合は、他のメカニズムについて検討する。 MALT1による細胞増殖抑制については、多数のドメイン欠失クローンを導入し、MTTを用いた細胞増殖アッセイを引き続き行う。カスパーゼ様ドメイン以外のドメインの関与が考えられる場合は、核移行シグナルtagを付与したクローンを用いて検討する。増殖抑制が確認された後、より詳細なメカニズムを解析する。
Causes of Carryover	研究に必要な試薬類の効率的使用に大きく努めたことにより、物品費を節約できた。