2022 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of pathogenic acquisition mechanism from the crystal structure of the collagen-binding proteins of Streptococcus mutans
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18K09735
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| Research Institution | Osaka Medical and Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
平田 あずみ 大阪医科薬科大学, 医学部, 准教授 (40263587)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高野 和文 京都府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (40346185)
田中 俊一 京都府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (70591387)
野村 良太 広島大学, 医系科学研究科, 教授 (90437385)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | コラーゲン結合タンパク質 / Streptococcus mutans / 機能解析 / 構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Streptococcus mutansが産生するコラーゲン結合タンパク質Cnm/Cbmは約120kDaのタンパク質で、コラーゲン結合ドメイン（CBD）を介してコラーゲンに結合する。この結合メカニズムを解明するために、CBDを構成する4つのドメイン、N1、Linker、N2、Latchに着目し解析を進めてきた。これまでに4つのドメインを組み替えた変異体を作製し、CDによる熱安定性測定とELISAによるコラーゲン結合活性測定を行うことにより、これら4つのドメインの役割をそれぞれ、N1：コラーゲンとの結合に寄与する、Linker：N1、N2を補助しコラーゲン結合を支持する、N2：構造安定性、コラーゲンとの結合において中心的役割を担う、Latch：N2を補助し、N2と相互作用することでコラーゲン結合を支持する、と予想している。本年は、Cbm_CBDの4つのドメインの予想される機能と構造の相関を結晶構造学的に裏付けることを目的に、前年に引き続き、これまでに作製したCbm_CBDの各領域変異体の結晶化を継続実施した。一方、本研究では大腸菌を用いてCbm_CBDのWTおよび19変異体の計20種の目的タンパク質を発現しているが、その過程において、Cbm_CBDの可溶性発現量は100㎎/培地1Lにもなり、精製後の最終収量が非常に多いという点、および、コラーゲンとの結合についてはKD: 3.17 micro-M を示すことを明らかにしてきた。そこで、これらの特徴を利用したコラーゲンカラムとしての活用法を検討した。カラム担体へのコラーゲンとの結合が最適な条件を設定したのち、昨年度作製したGFP_Cbmを用い、コラーゲンカラムとしての有用性を検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
①WTおよび19変異体タンパク質の結晶獲得には至っていない。
②Cbm_CBDとコラーゲンの結合を活用したコラーゲンカラムの作製を試みた。担体として数種類のビーズを用いたカラムを準備し、コラーゲン、GFP_Cbmを反応させ、GFPの精製カラムとしての有用性を検討した。
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| Strategy for Future Research Activity |
①結晶化条件の見直しを行い、Cbm_N2-N2~の結晶化を継続する。
②GFP_Cbmを用いてマウス各種組織におけるCbmの局在を明らかにする。
③学会発表および論文による成果発表
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| Causes of Carryover |
（理由）本年度は、結晶化用試薬の購入が少なかったこと、および、カラム作製に必要な試薬類が、予想よりも安価であったことによる。
（使用計画）次年度は、継続する結晶化用の試薬購入および生体組織採取のためのマウス購入の経費、成果発表の経費として充当する予定である。
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