癌幹細胞と口腔癌転移患者血液の２つに着目した転移特異的miRNA同定と診断法確立

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09745
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 高丸 菜都美 徳島大学, 病院, 助教 (40513031)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 宮本 洋二 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 教授 (20200214) ; 玉谷 哲也 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 非常勤講師 (30274236) [Withdrawn] ; 中川 貴之 広島大学, 病院(歯), 助教 (30456230) [Withdrawn] ; 大江 剛 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 徳島大学専門研究員 (60432762) [Withdrawn] ; 真野 隆充 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 准教授 (80325125) [Withdrawn] ; 栗尾 奈愛 徳島大学, 病院, 講師 (80622141)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: microRNA / 口腔癌 / 癌幹細胞

Outline of Annual Research Achievements

2019度の研究実績としては以下のことを行った。
Ⅰ．口腔癌患者の血液に着目した転移関連miRNAの選定と同定として、同一癌患者の口腔癌患者の根治手術後，担癌状態でないと考えられる時の血液①と，原発巣に再発がなく，転移が判明した時（体内に転移巣のみ存在している状態）の同一患者の血液②をサンプルとして，miRNAのマイクロアレイ解析（①と②）を行った。実際には血液サンプルを回収後，RNAを抽出し，東レ 3D-GeneRを用いてmiRNAのアレイ解析を行った。．数例の解析結果から，発現差が３倍以上あるmiRNAを，候補miRNAとして選定した。
上記で選定した転移に関連する候補miRNAの検証による転移特異的miRNAの同定を行った。
Ⅱ．癌幹細胞に着目した転移関連miRNAの選定と同定として、、当科で口腔癌細胞から樹立し、肺転移能を有する細胞株のB88細胞を用いた。当科でこれまで行ってきた研究の結果から、口腔癌の転移を起こす癌幹細胞は，ALDH1とSOX2を発現しているのではないかと考えているため、１）口腔癌組織におけるALDH1とSOX2をの癌幹細胞マーカー発現の検索を行った。また、２）B88細胞にALDH1とSOX2を強制発現させた癌幹細胞様細胞株の樹立した。ALDH1とSOX2のcDNAを発現プラスミド（オリジーンテクノロジーズ）に組み込み，selection後，それらの発現をRT-PCRで確認した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

前述のⅠ．口腔癌患者の血液に着目した転移関連miRNAの選定と同定．１）口腔癌患者の血液に着目した転移関連miRNA候補の探索と選定に関して，口腔癌患者の根治手術後，担癌状態でないと考えられる時の血液①と，原発巣に再発がなく，転移が判明した時（体内に転移巣のみ存在している状態）の同一患者の血液②をサンプルとして，miRNAのマイクロアレイ解析（①と②）を行い，その解析結果から，発現差が３倍以上あるmiRNAを，候補miRNAとして選定する予定としていたが，解析結果にばらつきがあり候補miRNAが絞り切れていないため、何度か解析を行い、それらの結果を持って総合的に候補miRNAを同定する．
また、癌幹細胞に着目した転移関連miRNAの選定と同定に関しては、ALDH1とSOX2を発現させた癌幹細胞様細胞株の樹立は行ったが、癌幹細胞に特異的な転移に関連するmiRNA候補の探索も、結果にばらつきがあり、候補が絞れない状態となっているため、もう一度樹立からやり直し、結果の動向を確認する

Strategy for Future Research Activity

転移に関連するmiRNAの機能解析を行う．具体的には，培養口腔癌細胞（SAS，CAL27， B88細胞）で同定したmiRNAの発現を調べる．インヒビターを用いて同定したmiRNAの機能を抑制，あるいはmiRNA発現プラスミドを用いて過剰発現させる．miRNAの発現を抑制あるいは強制発現した癌細胞のスフェロイド形成，足場非依存性増殖能をsoft agar assay，腫瘍形成能を調べ，癌幹細胞の特性を有しているか確認する．また，同定したmiRNAが治療の標的になり得るかを，マウスリン
パ節転移モデルを用いて検討する．同定したmiRNAが高発現している癌細胞をヌードマウス咬筋内に移植し，同定したmiRNAを標的とした抗腫瘍効果と転移抑制効果を確認する．具体的には，腫瘍体積が100 mm3を超えた時点で，miRCURY microRNA Inhibitorとアテロコラーゲンを複合化させ，200μlの溶液としたものを，1週間に一度腫瘍近傍へ投与する．腫瘍体積を測定し，30日後に腫瘍を摘出する．転移巣での癌細胞の有無，腫瘍での同定したmiRNAの発現，癌幹細胞の表面マー
カーの発現を比較検討する．また，癌細胞を尾静脈より注射し，肺に転移巣が形成される２週間後より，miRCURY LNA microRNA Inhibitorとアテロコラーゲンを２週間に４回投与する．その後，肺への転移数，肺重量を測定し，腫瘍内の同定したmiRNAの発現を定量する．以上の結果より，同定したmiRNAが遠隔転移に関与し，癌治療の標的となるか，動物実験で明らかにする．

Causes of Carryover

2019年度に購入予定であった物品の多くは，当教室で有している物品等を使用することで研究を遂行することが可能であった．そのため予定額より少額で済み、差額を次年度使用額とした．
次年度は，転移に関連するmiRNAの機能解析を行う．そのために，培養液,培養ディッシュなど培養に関連した消耗品やmiRNAの機能を抑制，あるいはmiRNA発現プラスミドを用いて過剰発現させるための試薬が必要である．さらに得られたトランスフェクタントを動物実験に供し,miRNAが治療の標的になり得るかをin vivoで検討するために,動物実験に関する消耗品が必要であり、次年度請求額と合わせ使用予定である。