2019 Fiscal Year Research-status Report

変形性顎関節症の新規治療法の開発を目指したLubricinの発現調節機構の解明

Research Project

Project/Area Number	18K09769
Research Institution	The University of Tokushima
Principal Investigator	栗尾奈愛徳島大学, 病院, 講師 (80622141)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	福田直志徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 助教 (10804156) 宮本洋二徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 教授 (20200214) 中川貴之徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 助教 (30456230) 高丸菜都美徳島大学, 病院, 助教 (40513031) 大江剛徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 徳島大学専門研究員 (60432762) 真野隆充徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 准教授 (80325125)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	PRG4 / tgfb / TMJ-OA / p38 / ERK
Outline of Annual Research Achievements	変形性顎関節症(TMJ-OA)は顎関節を構成する骨軟骨の破壊を特徴とし、関節痛や開口障害により患者のQOLを低下させる。これまで変形した関節を修復させる根本的治療法は確立されておらず新規治療法の開発が望まれるが病態が不明であることが多く発症機序の解明が必要である。Lubricinは滑液中に含まれるプロテオグリカンでPRG4遺伝子によってコードされる。軟骨面の摩擦抵抗を軽減し、軟骨を保護している。四肢関節ではTGF-βが Lubricinの発現に重要であり、本研究では顎関節のLubricin産生におけるTGFの役割と分子調節機構の解析を目的とした。これにより、TMJ-OAの発症機序の一因を明らかとし、予防法や新規治療法の確立を模索する。平成31年度は引き続き、PRG4プロモーターの制御下において蛍光mCherryを発現するレポーターマウスの顎関節から単離した細胞を用いて各種の実験を行った。PRG4遺伝子発現にはTGF-β1によりリン酸化されたSMAD2/3が重要であることを示したが, 平成31年度はSMADシグナルだけでなく, p38やERKなどのnon-canonical経路もまたPRG4遺伝子の発現に重要であることを発見した. 現在はPRG4遺伝子の発現にSMADシグナルとnon-canonicalシグナルがどのようなクロストークを示すのか検討中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 令和元年度も引き続き, PRG4プロモーターの制御下において蛍光mCherryタンパクを発現するPRG4レポーターマウスの顎関節から酵素処理により単離した細胞を用いて各種の実験を行った。単離後の細胞を種々の濃度のTGF-β1で処理した際のLubricinの発現量の違いをreal-time PCR、RT-PCRで確認を行った。関節の最表層から単離された細胞のみがTGF-β1刺激によってLubricinの遺伝子発現の促進が認められた。それよりも下層の細胞ではLubricinの遺伝子発現は認められなかった。またLubricinの遺伝子発現にはTGF-β1によりリン酸化されたSMAD2/3が重要な役割をになっており、これらの阻害剤を用いることによりLubricinの遺伝子発現を抑制することをウェスタンブロットにて確認した。さらにPRG4レポーターマウスから下顎頭軟骨を摘出し器官培養を行いTGF-β1で処理してin vivoでのPRG4の発現を検討。その結果、PRG4遺伝子の発現はin vitroの実験と同様に顎関節の最表層でのみ発現が認められ、TGF-β1刺激によりPRG4遺伝子の発現が促進された。またALK5, SMAD2/3の阻害薬で処理することによりPRG4の遺伝子発現は完全に抑制されたことからTGF-β1によるPRG4遺伝子発現はALK5を介したSMAD2/3シグナルが重要な働きを担うことが確認された。さらにPRG4遺伝子の発現はTGF-βのcanonical経路のみならず, non-canonical経路によっても調節を受けている可能性が示された。またin vivoの実験として PRG4CreERT2マウスとTGF-βR2flox/floxマウスを交配しLubricin産生細胞特異的なCKOマウスを作製し、H-E染色、Safranin-O/Fast Green染色等を用いて顎関節を形態学的に解析しているが, 表現系が安定していないため, n数を増やして解析を行っている。
Strategy for Future Research Activity	PRG4CreERT2マウスとTGF-βR2flox/floxマウスを交配しLubricin産生細胞特異的なCKOマウスを作製し、H-E染色、Safranin-O/Fast Green染色等を用いて顎関節を形態学的に解析を引き続き行っていく。同マウスの顎関節におけるPRG4遺伝子やLubricinタンパクの発現をin situ hybridization、免疫組織学的染色を用いて染色し、TFG-βシグナルの減少がLubricinの発現に影響を与えるか引き続きin vivoで確認する.
Causes of Carryover	次年度の動物実験を一括して行うこととなり、次年度使用が生じた。次年度請求分と合わせて使用する予定である。