2018 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of mechanisms of mutations from DNA damage using genome editing and site-specifically modified plasmids
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18K11656
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
八木 孝司 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (80182301)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川西 優喜 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (70332963)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 突然変異 / DNA修復 / 損傷乗越えDNA複製 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ゲノム編集（CRISPR/Cas9法）により、損傷乗越えDNAポリメラーゼ Polη、ι、κ、ζ各々の標的配列とガイドRNAとを連結し、Cas9を発現するターゲットプラスミドを作製した。これらをXP-A細胞に導入し抗生物質（ハイグロマイシン）抵抗性クローンを複数選択した。それらのクローンのシーケンス解析および発現解析の結果、Polη、ι、κ欠損細胞が作製できた。但しPolκは致死となることを避けるために、C末付近のPIP Boxを標的としたため、一部truncateしたタンパク質が発現している。それらの細胞のUV感受性をコロニー形成法で調べた結果、Polη欠損細胞のみ親株のXP-A細胞より高感受性であった。その他の欠損細胞はXP-A細胞と同程度のUV感受性を示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成30年度交付申請書記載のとおり進捗している。具体的には、Pol η、ι、κ、ζ各々の標的配列とガイドRNAを連結し、Cas9を発現するターゲットプラスミドを作製し、XP-A細胞に導入し抗生物質で選択する。各々のポリメラーゼにつき数クローンを選び、ターゲット付近の塩基配列を決定し、両アレルに変異が入ったクローンを選択した。Pol η、ιはN末付近のCatalytic domainを、Pol κ、ζはC末付近のPIP Boxを標的とした。その結果、Pol η、ι、κを欠損したXP-A細胞が作製できた。
現在、３ーニトロベンズアントロン（NBA）をSupFを突然変異標的とするシャトルベクタープラスミドに処理し、Pol η、ι、κ、ζを各欠損したXP-A細胞で生じた突然変異率、突然変異の種類を細胞間で比較している。
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| Strategy for Future Research Activity |
SupFシャトルベクタープラスミドに ３ーニトロベンズアントロン（NBA）活性体を処理し、Pol η、ι、κ、ζを各欠損したXP-A細胞で複製させたのち、大腸菌に導入し、各細胞でSupF遺伝子に生じた突然変異率、突然変異の種類を細胞間で比較する（untargeted mutagenesis）。３種類のNBA付加体をもつ15 merオリゴヌクレオチドを各々作製し、これらオリゴヌクレオチドをLacZレポータプラスミドの一本鎖ギャップに挿入する。これらのプラスミドをPol η、ι、κ、ζ を各々欠損したXP-A細胞に導入し複製させ、欠損細胞間でTLS率、突然変異率を比較する（targeted mutagenesis）。同様の研究をシスプラチン付加体についても行なう。
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| Causes of Carryover |
データ整理や恒常的実験業務を学生と共に自らで行なったため、人件費・謝金を使用せず、主にその金額を次年度に繰り越した。次年度は研究の実験量が増えることが見込まれ、繰り越し分を物品費に使用する予定である。
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