2022 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of mechanisms of mutations from DNA damage using genome editing and site-specifically modified plasmids
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18K11656
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| Research Institution | Osaka Metropolitan University |
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Principal Investigator |
八木 孝司 大阪公立大学, 大学院理学研究科, 客員教授 (80182301)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川西 優喜 大阪公立大学, 大学院理学研究科, 教授 (70332963)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 突然変異 / 損傷乗り越えDNA複製 / DNA損傷 / DNA修復 / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNA損傷を持ったままDNAポリメラーゼδとεがDNA複製を開始すると、DNA鎖の伸長が損傷部位で停止し、細胞死となる。しかし多くの生物の細胞では、損傷乗り越えDNA複製（TLS）とよばれる機構により、DNA複製を進めることができる。しかしTLSにはたらくDNAポリメラーゼ（Polη、κ、ιなど）の忠実度は低く、複製の際に突然変異を生じさせる。DNA損傷の種類によってはたらくTLSポリメラーゼの種類は異なるが、損傷の種類とはたらくTLSポリメラーゼの関係は明らかでない。我々はCRISPR/Cas9法によってヌクレオチド除去修復を欠損するヒトの色素性乾皮症（XP）細胞を用いてTLSポリメラーゼを欠損した細胞（ΔPolη、Δκ/PIP、ΔPolι）を作製した。
これまで、これらの細胞に３ーアミノベンズアントロン（ABA：NBAの代謝活性体）、紫外線（UV）、シスプラチン（CisPt）を処理後、ΔPolηXP細胞がこれらに対し他の細胞より高感受性となることを明らかにした。また、NBA付加体をLacZ遺伝子中のグアニンに１分子もつSupFシャトルベクターを作製して、TLSが細胞中で起こると大腸菌コロニーの色が付くシャトルベクター系を開発した。これを用いて、PolηがNBA付加体の突然変異生成に寄与していることが示唆された。さらに、dG-C8-N2-ABAが最もシャトルベクターの複製率を低下させた。dG-C8-N2-ABAには主にPolηがError-free TLSに関与することがわかった。シスプラチン（CisPt）付加体をLacZ遺伝子に１分子だけもつシャトルベクタープラスミドを完成させた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
新型コロナウィルス感染症の第８波で私自身がおよび研究室の約半数の学生がそれぞれ感染して欠席し、前期は研究が遅れたが、後期は徐々に研究ペースを取り戻すことができた。学会発表はリモート参加となり、研究情報の交換に支障をきたした。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はNBA付加体の化学構造とPolηとのより詳細な関係、および他のTLSポリメラーゼの寄与を明らかにする。さらにシスプラチン（CisPt）付加体を１分子だけもつ シャトルベクターを用いてPolη、κ、ιのTLSへの寄与を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウィルス感染症拡大のため、学会参加等の旅費の使用が予定より少なかった。
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