2018 Fiscal Year Research-status Report
LLB Phage: Novel approach to eliminate food poisoning bacteria
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18K14378
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
益田 時光 九州大学, 農学研究院, 助教 (90778060)
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2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | bacteriophage / leaderless bacteriocin / CRISPR-Cas |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、リーダレスバクテリオシン（LLB）を生産するバクテリオファージ（ファージ）を構築し、食中毒細菌の制御における全く新しい手法を創出することを目的としている。さらに、ファージの遺伝子改変におけるCRISPR-Cas3システムを用いた新たな組み換えファージスクリーニング法の確率にも取り組んでいる。
初年度においては、当初の計画の通り、モデル生物である大腸菌をターゲットとしてT7ファージを用いて研究を進めてきた。LLBとしては抗菌活性に優れるlacticinQ（LnqQ）を用い、合成遺伝子を作成、ファージゲノムへの相同組換え実験を行った。LLB遺伝子の導入箇所などの要素は今後検討していく必要がある。
リアルタイムPCRを利用して、相同組換え実験後のファージ溶液中にLLBファージが存在していることを確認することに成功したが、予想通りその効率は、20000ファージに1つほどという、非常に低いものであった。そこで、CRISPR-Cas3システムの構築を試みた。すでに、システムに必要な遺伝子群（casABCDE, cas3, crRNA）を組み込んだベクタープラスミドを作成し、大腸菌内で発言する系を構築したが、各遺伝子の発現がシステムとして機能するには不十分であるという課題があり、現在その改善を行っている。
CRISPR-Cas3によるスクリーニング法が現在予定通りではないため、代替案として検定菌を2種用いたプラークアッセイ法を構築し、LLBファージの単離を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予定では、初年度は大腸菌を用いたモデル実験系を確立する予定であった。実際に、LLB遺伝子を組み込めたであろうLLBファージの存在をリアルタイムPCRによって確認できている。ただし、CRISPER-Cas3システムを用いた組み換えファージスクリーニング法の確率という点に関しては予定していたような結果が現在得られておらず、改善に努めている。
一方で、CRISPR-Cas3システムに変わる新たなスクリーニング法として、ファージ感受性宿主とLLB感受性検定菌を共培養しながら検定菌として用いるプラークアッセイとLLB活性試験を組み合わせたスクリーニング法を考案し、LLBファージの単離に取り組んでいる。そのため、LLBファージの構築という本来の目的においては順調に進んでいると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、引き続き大腸菌を用いてLLBファージとCRISPR-Cas3システムの構築を勧めていく。また、T7ファージというモデル系だけでなく、腸管出血性大腸菌を標的としたLLBファージの構築も進めていく。
当初の計画では、グラム陰性食中毒細菌に対するファージを用いていく予定であったが、今後は、まず、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus（SA））を標的としたLLBファージの構築も並行して行っていく。当グループでは昨年、優れたSAファージを複数単離し、そのゲノム情報の解読を行った。これらのファージをもとにして、LLB遺伝子の導入箇所などを検討し、新たなSA-LLBファージの構築を目指す。その後、薬剤耐性ブドウ球菌等への抗菌活性など、応用的な試験も行って、LLBファージの有用性について検証していく。
大腸菌LLBファージ構築の進捗状況に応じて、サルモネラやカンピロバクターに対するLLBファージについても実験を進めていく予定である。
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