2018 Fiscal Year Research-status Report
骨形成制御におけるイオンチャネル発現・活性変動の役割と創薬への応用
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18K14929
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
鬼頭 宏彰 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 助教 (40749181)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 前骨芽細胞 / KCa3.1 / Kir2.1 / 細胞増殖 / 細胞分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前骨芽細胞の細胞増殖・細胞分化は骨組織恒常性維持において重要な役割を果たしている。我々は、マウス前骨芽細胞MC3T3-E1を用いて細胞増殖・細胞分化におけるイオンチャネルの役割を検討した。これまでの検討により、MC3T3-E1細胞には中コンダクタンスCa活性化KチャネルKCa3.1が機能発現することを明らかにしている。今検討により、細胞増殖に対するKCa3.1の役割を検討したところ、細胞周期依存的にKCa3.1発現・活性が変動し細胞内Caシグナルを修飾することによって細胞増殖の制御に関与することが明らかになった。
細胞分化に対するイオンチャネルの役割を検討したところ、骨芽細胞への分化成熟過程において内向き整流性KチャネルKir2.1の発現が亢進し、骨芽細胞分化の制御に関連することが示された。Kir2.1は活性化により深い静止膜電位の形成に寄与することが考えられたため、細胞膜電位に対するKir2.1阻害作用を検討したところ、骨芽細胞分化によりKir2.1依存的な膜電位成分が増加した。骨芽細胞分化マーカー（ALP及びBSP）の発現およびALPの酵素活性を評価したところ、Kir2.1の阻害により発現・活性の有意な低下が認められたことからKir2.1は骨芽細胞分化を正に制御する因子であることが予想された。
以上の結果より、KCa3.1及びKir2.1は骨芽細胞増殖及び細胞分化の制御において重要な役割を果たすことから、骨形成制御を目的としたイオンチャネル創薬の標的分子としての可能性を検討していきたい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前骨芽細胞、骨芽細胞を含む骨芽細胞関連細胞の細胞増殖は骨形成において重要な役割を果たしていると考えられている。これまでの検討により、KCa3.1がマウス前骨芽細胞MC3T3-E1の細胞増殖を正に制御することが明らかになった。今検討においてKCa3.1の前骨芽細胞増殖に対する役割を詳細に検討するために、細胞周期依存的なKCa3.1の発現・活性を検討した。その結果、S/G2/M期と比較してG0/G1期の細胞群において有意にKCa3.1の発現・活性が亢進することを明らかにした。さらに、KCa3.1選択的阻害薬であるTRAM-34の投与により、G0/G1期の細胞集団の割合が増加した。以上の結果より、KCa3.1はG1期からS期の細胞周期進行に関与することで細胞増殖の制御に関与する可能性を明らかにすることができた。
骨芽細胞の成熟には、骨芽細胞分化も重要なプロセスである。これまでの検討から骨芽細胞分化に伴い、内向き整流性カリウムチャネルKir2.1の発現が亢進することを示してきた。今検討では骨芽細胞分化によるKir2.1の役割を評価するために、Kir2.1発現亢進に由来する膜電位変化及び細胞内カルシウムシグナルへの影響を検討した。その結果、骨芽細胞分化によりKir2.1が発現だけではなく機能レベルにおいても亢進することが骨芽細胞分化に大きく寄与することが明らかとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
MC3T3-E1における細胞周期依存的なイオンチャネル活性をより詳細に検討することで、細胞周期進行におけるKCa3.1の寄与を明らかにする。細胞周期同調培養により各細胞周期におけるKCa3.1膜電流、Ca2+動態、静止膜電位、イオンチャネル発現を比較する。さらに、KCa3.1の細胞周期依存的な発現変動のメカニズムを明らかにするために、KCa3.1転写制御因子であるActivator protein 1 (AP-1)や負の制御因子であるREST等の細胞周期依存的な発現変動を検討する。細胞増殖制御に関わるKCa3.1に加えて、細胞分化に関わるKir2.1の転写制御機構をレポーターアッセイで検討するとともに、microRNAを介したKir2.1 mRNAの分解機構についても検討することで、骨芽細胞分化におけるKir2.1発現亢進機構について明らかにする。
これまでの検討は培養細胞を用いた実験だったため、より生理的な条件における骨芽細胞分化に対するKir2.1の役割を検討するために、マウス中足骨を用いた軟骨内骨化モデルを用いて骨芽細胞分化に対するKir2.1の寄与を検討する。
細胞増殖・分化の制御におけるCa2+シグナルの役割を明らかにするために、骨芽細胞が分泌するサイトカインや細胞間因子について検討する。特に骨芽細胞の産生するインスリン様成長因子（IGF）や線維芽細胞成長因子（FGF）の発現変化や各因子に対する感受性変化に関して検討する。
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