Elucidation of the mechanism of methylation maintenance of imprinting region using iPS cells

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K15686
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 奥野 博庸 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (70445310)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: インプリンティング / プラダーウィリー症候群 / 視床下部 / iPS細胞

Outline of Annual Research Achievements

申請者はこれまでにインプリンティング疾患として有名なプラダー・ウィリー症候群患者よりiPS細胞を樹立し、欠失型PWSでは健常人由来細胞に比べてiPS細胞化に伴いインプリンティングが部分的に解除されやすいことを見出した。PWS-iPS細胞を用いた患者モデルをin vitroで作成するためにはメチル化が維持される必要がある。また PWSは視床下部に関連する症状を主に有しており、iPS細胞由来視床下部がin vitroモデルのターゲットとなると考える。Zhang Y.らの神経誘導方法で（Zhang Y et al, 2013, Neuron）視床下部ニューロンの前駆体で発現するマーカーを有することが別実験でわかり、本誘導方法を用いるべく遺伝子導入した神経細胞誘導株を作成した。これを用いて、視床下部の誘導を試み、発生過程と同様の遺伝子発現を一部認めた。またMeCP2結合領域を欠失させたiPS細胞の株化を試みているところである。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

インプリンティングのメカニズムと並行して、PWS-iPS細胞を用いたin vitroモデル作成を作り、病態メカニズム解明や創薬スクリーニングに役立てたいと思っている。2018年にhES細胞より視床下部誘導の方法が報告されている(Ogawa et al. Scientific Reports 2018)が、誘導期間が80日と長期間培養する必要があり、誘導効率も<1%と悪い。この誘導方法をより短期間に、より高効率にしたものを開発することはPWSに限らず、今後の視床下部疾患全般に使用可能な誘導方法
となり、とても有用である。順調に株化した神経細胞誘導株から、視床下部への誘導過程で生じるマーカーの出現を認めている。またMeCP2結合領域を欠失させたiPS細胞株を遺伝子編集技術を用いて作成しているが、株化することがうまく行っておらず改良中である。

Strategy for Future Research Activity

視床下部への分化誘導を進める。また遺伝子改変を再度試みて、目的とするiPS細胞株の取得を目指す。本領域に特化した欠失が難しい場合は、より広く欠失したiPS細胞の株化したものを樹立することとする。

Causes of Carryover

遺伝子改変によるiPS細胞株の樹立がうまく行かずに、それを用いた培養やメチル化解析が次年度に持ち越されたため、次年度にこれまでの計画に加えて、該当する培養および解析を実施することとした。