2019 Fiscal Year Research-status Report
CDDP耐性肝芽腫におけるメチル化異常の解明と新規治療法の探求
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18K16250
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
荒 桃子 北海道大学, 大学病院, 医員 (30741219)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 肝芽腫 / シスプラチン耐性 / DNAメチル化 / 遺伝子発現変動 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
肝芽腫は胎児肝の発生過程におけるエピゲノム異常、特にDNAメチル化異常が発癌、進展および悪性化における主要な調節機構になっている。これは予後不良なシスプラチン(CDDP)耐生への関与にも想定され、本研究は肝芽腫におけるCDDP耐性に関与するエピゲノム異常、遺伝子発現異常を解析し、分子マーカーの確立、耐性の解除・新たな治療ターゲットを模索することである。
CDDP感受性群6例、CDDP抵抗性群5例のDNAを対象に網羅的DNAメチル化ビーズアレイ解析を行った(2018年度に施行)。更には肝芽腫細胞株であるHuH6を用いて、CDDPへの断続的、段階的な3か月間の暴露により抵抗性株(HuH6CR)を作成した。HuH6CRとHuH6WTよりRNAを抽出し、マイクロアレイを用いて網羅的遺伝子発現解析を行い、発現低下しているCDDP抵抗性候補遺伝子の選定を行った。メチル化ビーズアレイとマイクロアレイの結果より、CDDP抵抗性肝芽腫において高メチル化、低発現している遺伝子を選定し、さらに統計学的解析手法を用いて、CSF3RをCDDP抵抗性に最も関連遺伝子として選定した。肝芽腫43例を対象とし、バイサルファイトパイロシークエンシング法によりCSF3Rのメチル化率を測定した。メチル化ビーズアレイを施行した症例において、メチル化ビーズアレイの結果とパイロシークエンシングの結果が統計学的に相関することを確認した。術前CDDP感受性患者38例の検査結果より、高メチル化群と低メチル化群に群別化し、再発曲線を比較した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
メチル化ビーズアレイの結果により、CDDP感受性患者において28,556プローブ(6,775遺伝子)が高メチル化しており、CDDP抵抗性患者において15,102プローブ(4,637遺伝子)が高メチル化していた。これらのCDDP抵抗性患者および感受性患者における高メチル化プローブの中で、おのおの17%と16％がTranscriptional Start Siteであり、21%と5%がCpGアイランドであった。教師なし階層的クラスター解析およびPrinciple Component Analysisでは、そのメチル化傾向により、患者群をGroup1とGroup2に群別化した。CDDP感受性患者のメチル化傾向は類似していたが、そこから逸脱するに従いCDDP抵抗性を獲得し、悪性度が上昇する傾向がみられた。また、Group1はGroup2に比較し、全生存率と無再発生存率はともに有意に悪かった。作成したHuH6CRとHuH6WTのCDDP抵抗性をIC50算出により比較し、HuH6CRで有意に高値であることを確認した。HuH6WTとHuH6CRマイクロアレイ解析より、HuH6CRで有意に発現低下したのは119遺伝子であった。これらのデータを用いて、CDDP抵抗性関連候補遺伝子として5遺伝子を選定し、その中から統計学的に最もCDDP抵抗性と関連が強かったCSF3RをCDDP抵抗性遺伝子として選定した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度絞り込みを行った候補遺伝子の抽出に続き、これらのアレイデータを用いて、エピジェネティックな発現制御が疑われる遺伝子、CDDP負荷時に生存のために発現変動しうる遺伝子など、様々な状況でのCDDP耐性のキーとなる遺伝子、pathwayの解析を行う。研究を進めていくうちに、CDDP暴露後に遺伝子発現プロファイルが大きく変動していることもわかったため、定常状態での遺伝子発現プロファイルの比較に加え、CDDP暴露直後の各細胞株よりRNAを抽出して発現アレイを施行し、発現プロファイルを比較する。これらのアレイデータを解析し、CDDP耐性に関与する遺伝子をより信頼性高く抽出する。
新たに網羅的メチル化解析(MethylationEPIC BeadChipアレイ)を追加施行し、これまでのメチル化解析データに更なる詳細なメチル化情報を加えることで、新知見につなげることを目的に外注委託解析を発注しており、これから結果の解析をおこなう。
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| Causes of Carryover |
メチル化ビーズアレイ解析の検体数が当初予定していた数より少なく済んだため次年度使用額が生じた。今回の解析により抽出した候補遺伝子に対する個別のメチル化解析のためのバイサルファイトパイロシークエンシング解析試薬および新規候補遺伝子として着目しているRNA発現解析試薬に使用する予定である。
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