2007 Fiscal Year Annual Research Report
日本人アトピー性皮膚炎におけるフィラグリン遺伝子異常の解析
| Project/Area Number |
19591324
|
|---|
| Research Institution | Osaka City University |
|---|
Principal Investigator |
深井 和吉 Osaka City University, 大学院・医学研究科, 准教授 (20244642)
|
|---|
| Keywords | アトピー性皮膚炎 / フィラグリン / 遺伝子変異 / 角質 |
|---|
| Research Abstract |
972塩基の繰り返し配列そのものを、以下のプライマーでPCR増幅し、それをTA-cloning vectorにクローニングし、おのおののクローンをシークエンスした。
FLGrepF5'-TCCTCTACCAGGTGAGCACTCA-3'
FLGrepR5'-AGACCCTGAACGTCCAGACCTT-3'
proof reading活性の高い酵素である、platinum Taq high-fidelity DNA polymeraseを使用して、PCRを行う。それをゲル精製する。TA-cloning vectorにクローニングする。得られたクローンを、一検体につき36クローンについて、mini-preparationを行う。Plasmid DNAをtemplateとして、BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kitを用い、シークエンス反応を行う。反応産物は、医局で運用している310キャピラリーシークエンサーに流して、塩基配列を解読する。長い配列を読める(600塩基)ように、シークエンサーを設定し、TA-cloning vectorのM13-forward primerおよびM13-reverse primerにより、972塩基のすべてを前からと後ろから解読する。得られた塩基配列は、DNAstar遺伝子解析ソフトでalignmentを行い、前から読んだ配列と後ろから読んだ配列を、一本化する。一本化した配列は同じソフトを使用して、コンピューター上で翻訳し、ナンセンス変異や、挿入変異、欠失変異がないかを確認する。
8症例の検討により、3種類の病的変異をこの方法により見出した。
|
Research Products
(4 results)
