2007 Fiscal Year Annual Research Report
長期増強現象を担うPDZドメイン含有蛋白質の網羅的分子スクリーニング法の開発
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19659052
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
廣瀬 謙造 Nagoya University, 大学院・医学系研究科, 教授 (00292730)
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| Keywords | シナプス可塑性 / 中枢神経 / PDZドメイン / 長期増強 / スクリーニング |
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| Research Abstract |
本研究ではLTPなどのシナプス可塑性の制御に関わるPDZタンパク質を、網羅的かつ低コストで精度良く解析する技術基盤を確立し、シナプス可塑性を制御するPDZタンパク質をゲノムワイドに探索することを目的としている。この目的のため、平成19年度においては、AMPA型グルタミン酸受容体GluR1サブユニットのシナプス後部細胞膜への移行をモニターするアッセイ系の構築を行った。当初計画に従って、細胞外領域にタグ配列を付加したGluR1サブユニット発現コントラストを複数種類作製した。続いて、培養海馬神経細胞にこれらのコンストラクトを導入し、この中から検出に最適なタグを検索した。その結果、HAタグが最適であることが明らかとなった。また、異なった蛍光波長特性を持つ蛍光色素で標識された抗HAタグ抗体を用いることによって、HAタグ標識GluR1が細胞膜と細胞内のどちらにどの程度存在するのかを定量的に評価することが可能になった。さらに、アッセイ系の感度向上のためには遺伝子導入効率が高いことが望まれることから、遺伝子導入法の最適化を行った。次年度で開始予定であるsiRNA発現ベクターを用いたスクリーニングに向け、EPRIL (Enzymatic Production of RNAi Library)法と呼ばれるsiRNAライブラリー作製技術に改良を加え、多種類PDZタンパク質を標的としたsiRNA発現コンストラクトを効率よく作製するための技術がほぼ完成した。
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