2019 Fiscal Year Annual Research Report
Development of new cell preservation technologies utilizing antifreeze protein
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19H02529
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
津田 栄 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 上級主任研究員 (70211381)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大山 恭史 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (80356675)
近藤 英昌 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (80357045)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 不凍タンパク質 / Antifreeze Protein / 準ガラス化状態 / 過冷却 / Supercooling / 熱ヒステリシス / 微細氷結晶 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、細胞質内を微細氷結晶で埋め尽くした「準ガラス化」状態にすることによって零℃以下で保存中の細胞の生命力を保ち、その生存時間の大幅延長を達成することである。不凍タンパク質（AFP）にはそうした機能があると考えられる為、既にある魚類IーIII型AFPに加え、担子菌類（Typhula Ishikariensis）と子嚢菌類（Antarctomyces psychrotropicus）から新たなAFPを単離精製し、それらの遺伝子組換え体を作製した。また、単結晶氷サイズの定量、昆虫体液の準ガラス化状態を安定化する新たなAFPの作製に着手し、AFP遺伝子組換え体や人工脂質二重膜ナノディスクの作製も開始した。次いで、精製方法が確立されたAFP試料について氷結晶を極微小サイズに留める能力、すなわち氷の再結晶化阻害機能（Ice Recrystallization Inhibition, IRI）の定量解析実験を行った。個々のAFP試料の水溶液を低温ステージ付顕微鏡にセットし、視野中に観察される単結晶氷の径の変化をオストワルド成長式を使って解析した。その結果、AFP試料をIRI活性が強い順に並べると担子菌AFP ＞ AFPII ＞ AFPIII ＞ AFPI > 不活性型AFPIII の順になることが判明した。各々が微細氷結晶の形成をもたらす濃度は極めて低く、各々0.3、0.6、3.0、4.7、7.7 マイクロモルと見積もられた。このデータを基に、低温に弱い実験動物として知られる線虫（C.elegans）の体内に担子菌AFPまたはAFPIIIの遺伝子を組み込み、それらが低温に耐えられるようになるか否かを解析した。その結果、マイナス5℃で24時間飼育後の生存率が野生型線虫では僅か7％だったのに対し、担子菌AFP発現型線虫では72%にも上ることが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的は、細胞質内を微細氷結晶で埋め尽くした「準ガラス化」状態にすることによって零℃以下で保存中の細胞の生命力を保ち、その生存時間の大幅延長を達成することである。そのためには、どの種類のAFPが良いのかを明らかにした上で、そのAFPの大量生産法や細胞内導入法を明らかにし、より強力に「準ガラス化状態」を安定化するAFPを探索する必要がある。R1年度はAFPの種類に応じた安定化性能の差を定量的に評価することに成功し、性能の優れた担子菌AFPを組み入れた線虫（C.elegans）がマイナス5℃下で生存可能になることを明らかにした。これらの結果はオープンアクセス誌（Scientific Reports）に掲載したほかプレス発表も実施した。氷結晶サイズの定量法開発、人工脂質二重膜の作製、モデル細胞であるラット膵島細胞の培養など計画通りに進捗している。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究の目的は、細胞質内を微細氷結晶で埋め尽くした「準ガラス化」状態にすることによって零℃以下で保存中の細胞の生命力を保ち、その生存時間の大幅延長を達成することである。線虫（C.elegans）の実験では、既存の遺伝子組換え法を用いることで筋肉細胞や腸管細胞内にAFPを導入することができた。しかし、保存液に浸した状態の細胞内にAFPを侵入させるための方法は未知のため、急ぎ検討する必要がある。この目的の為に、遺伝子組換え技術を用いた膜透過ペプチド付加型AFPの作製を急ぐ。また電気穿孔法（エレクトロポレーション）を用いたAFPの細胞質内導入実験も行う。カジカ由来AFPと昆虫由来AFPについては、特に操作をしなくても細胞内に侵入する性質をもつことが予備的実験から示唆されており、これらのAFP試料の作製も急ピッチで進めたい。
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