2020 Fiscal Year Annual Research Report
Clarification of the molecular mechanism how zinc deficiency is associated with IBD
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19H02883
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
神戸 大朋 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (90303875)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
片山 高嶺 京都大学, 生命科学研究科, 教授 (70346104)
高橋 正和 福井県立大学, 生物資源学部, 准教授 (80315837)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 亜鉛欠乏 / 炎症性腸疾患 / アルカリフォスファターゼ / 亜鉛吸収促進因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
亜鉛欠乏がIBDの発症や憎悪に関わる分子メカニズムとして、腸型アルカリフォスファターゼ（IAP）などの亜鉛要求性酵素の活性低下が原因であることを細胞レベルで証明することを試みた。IAPがIBDに関わると考えられる理由としては、IAPが有する腸内のグラム陰性菌由来のLPSやポリリン酸のリン酸基の加水分解できる活性が亜鉛欠乏状態では低下し、その結果、その毒性が低減化されないためと考えられている。このモデルのもとに解析を進め、さまざまな酵素をスクリーニングした結果、IAP以外にもTNAPやENPP3などいくつかの酵素が関与する可能性を見出した。これら酵素を発現する培養細胞を樹立して、亜鉛欠乏下で培養し、産生されるIAP、TNAP、ENPP3によるLPSおよびポリリン酸のリン酸遊離活性を測定した結果、確かにリン酸遊離活性が低下することを確認した。実際にLPSやポリリン酸、または両者を合わせて加水分解させ、細胞培養液に添加してIL-6、IL-8およびTNFα産生をELISAや定量PCRにより評価しているが、現時点では有意な差を見いだせていない。細胞系の再検討が必要と考え、現在解析を進めている。本解析と並行して、動物実験においてALPを直接経口投与して評価する解析系を立ち上げる目的で、分泌型ALPを安定発現させた亜鉛トランスポーター欠損細胞株を活用してホロ型ALP（亜鉛配位型）とアポ型ALP（亜鉛非配位型）を効率よく精製する系を構築することに成功した。
また、食品因子の探索では、様々な食品因子、抽出物から亜鉛吸収促進効果のある食品成分・抽出物を探索する。昨年度、いくつかの野菜からZIP4の発現を増強させる新規の活性を有すると思われる抽出物を見いだすことに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
LPSやポリリン酸を加水分解が亜鉛欠乏に関連することに示すことに成功しているが、その差異を細胞レベルで明確に示すことができていない。培養細胞系の再検討が必要であり、若干の遅れが生じている状況にある。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）「亜鉛欠乏」が「亜鉛要求性酵素の活性消失」を引き起こすことによってIBDが発症する分子機構の解明
① TLR4を過剰発現させた培養細胞を使用して、LPS, ポリリン酸、ATPなどによってIL-6、IL-8およびTNFαの各サイトカインレベルが増加する条件を確立し、この応答が通常条件および亜鉛欠乏の条件で培養した細胞から調整したIAP、TNAP、ENPP3によってどのように変化するか解析する。
② ①の解析系を確立した後、アピカル嫌気培養装置を使用し、より腸管内の環境に近い状態でも評価を行う。アピカル嫌気培養装置での培養では、アピカル側に分泌される亜鉛酵素量やその活性を定量し、サイトカイン産生量との関連性について解析する。
③ 腸炎誘導マウスを亜鉛欠乏食で飼育する。通常食での飼育に比べ、亜鉛欠乏食での飼育により腸管の亜鉛酵素活性が低下することことで、消化管組織中のサイトカインレベルが上昇し、消化管粘膜組織の炎症レベルが悪化することを示す。また、昨年度に分泌型ALPをホロ型とアポ型を精製する系を構築することに成功したため、本解析系をスケールアップして調整し、経口投与することによって、亜鉛によって活性制御されるALPが、消化管粘膜組織の炎症を抑制することを直接的に示す。
（２）亜鉛を充足させる食品の探索
様々な食品因子、抽出物から亜鉛吸収促進効果のある食品成分・抽出物を探索する。昨年度、野菜から見いだした抽出物からZIP4発現増強活性成分の同定を進める。また、ZNT1の発現を増強させる食品抽出物も見出すことに成功しているため、その成分の同定を進めるとともに、新規活性抽出物の探索を進める。 これまでに亜鉛吸収促進効果のある成分として同定したソヤサポニンBbや今回見いだした新規成分が、実際にIBDの予防や治療効果を発揮するかどうかについて、腸炎誘導マウスを用いて検証する。
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