2019 Fiscal Year Annual Research Report
褐藻類の有用多糖類およびカロテノイド類代謝関連酵素の探索と機能実証
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19H03039
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
井上 晶 北海道大学, 水産科学研究院, 准教授 (70396307)
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2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 褐藻類 / 多糖類 / アルギン酸 / フコイダン / ラミナラン / カロテノイド / β-カロテン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、コンブやワカメなどの大型褐藻類にみられる特徴的な多糖類やカロテノイド類の生合成および代謝経路の解明を目的として、それらに関わる酵素の機能解析を進めている。多糖類では、アルギン酸、フコイダン、およびラミナランを基質とする酵素、カロテノイド類ではリコペンから各種キサントフィルへの変換に関わる酵素の同定を目指している。本研究実施以前では、このような酵素は、褐藻のゲノムおよび遺伝子解析から一部のものが予測されているか、タンパク質としての存在が不明であった。
現在までに、遺伝子解析から予測できなかった褐藻のアルギン酸分解酵素を発現スクリーニングにより同定し、その組換えタンパク質の発現にも成功した。機能解析の結果、アルギン酸生合成生物では初めて、アルギン酸を不飽和単糖に分解する酵素をもつことを明らかにした。これまでに褐藻を摂餌する動物や一部のバクテリアなどのアルギン酸資化生物では、不飽和単糖は複数の酵素により順次代謝され、ピルビン酸へと変換されることが知られている。そこで、マコンブのトランスクリプトーム解析を行い、不飽和単糖を基質とする酵素のスクリーニングを行い、既知の酵素との配列比較から4つの候補タンパク質の遺伝子情報を得た。これらのcDNAについてはクローニングを行い、大腸菌発現により組換えタンパク質を生産、精製した。これらの活性を調べた結果、ひとつの候補タンパク質が不飽和単糖を還元し、2-ケト-3-デオキシ-グルコン酸が生じることが明らかになっった。
カロテノイド生合成関連酵素については、バクテリア由来の遺伝子を用いてリコペン生合成能をもつ大腸菌を作出した。さらに、ワカメから単離したリコペン-β-シクラーゼ候補遺伝子を導入した結果、細胞内にβ-カロテンが蓄積した。これにより、褐藻では初めてカロテノイド生合成に関わる酵素のひとつについて機能実証することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
褐藻では存在が不明であったアルギン酸分解酵素の発見を端緒として、アルギン酸合成能をもつ生物では初めて、自ら合成したアルギン酸を最小分解物である不飽和単糖にまで分解することを明らかにした。さらに、不飽和単糖を還元する酵素を同定し、その機能解析をほぼ完了するとともに、構造遺伝子解析により褐藻に寄生または付着した原核生物ではなく真核生物由来のものである確証を得た。これらの結果は、褐藻ではアルギン酸を構造多糖として合成しているだけではなく、自ら分解することでエネルギー源として利用できる可能性を示すものであり、今後の研究により、これまでに知られていないアルギン酸の生理学的役割の提案ができるものと考えている。また、不飽和単糖還元酵素の解析の際に、比較対象として褐藻分解細菌フラボバクテリウムUMI-01株の同種の酵素を用いた。興味深いことに、細菌由来の酵素では、これまでに知られていない不飽和単糖の酸化反応が認められた。このような反応の報告はこれまでに無く、生成物は還元反応産物と構造が異なると考えられた。そのため、自然界にはこれまでに知られている不飽和単糖の還元経路だけでなく未知の酸化経路も存在すると推察された。
カロテノイド生合成経路については、β-カロテンを基質とすると予測される3つの候補タンパク質に着目し、これらのcDNAを取得した。これまでに構築したβ-カロテン生合成能をもつ組換え大腸菌にそれぞれ導入し、細胞内に蓄積するカロテノイドについて調べたが、β-カロテン変換活性は検出されなかった。これらのタンパク質の発現について調べた結果、SDS-PAGEではその発現が検出できなかったため、褐藻由来のこれらのタンパク質の大腸菌生産は困難であると考えられた。真核生物をホストとすることで発現が改善すると考えられたため、β-カロテンの合成に必要な4つの遺伝子を導入したバキュロウィルスを作成した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの成果により、褐藻ではアルギン酸生合成細菌とは異なり、アルギン酸は不飽和単糖にまで分解され、2-ケト-3-デオキシ-グルコン酸に変換されることを明らかにした。この経路の最終産物は、これまでの知見からピルビン酸と予測されるが、褐藻では不明なままである。そのため、本経路の完全解明を目的として、それに関わる酵素の同定を目指す。また、コントロール実験として進めた際に得られた細菌由来の不飽和単糖の酸化物について精製を進めるとともにその構造の解明を進める。本化合物は、従来のアルギン酸代謝経路では報告されておらず、アルギン酸の新しい代謝経路解明の端緒となり得る。そのため、細菌における本経路の解明を進め、褐藻においても同様の経路の有無について検討する。この研究については、当初予期していなかったものであるが、自然界におけるアルギン酸の新しい代謝機構の発見につながるものであり、アルギン酸の有効利用を進める上でも重要な知見をもたらすと考えている。
また、他の多糖分解酵素については、これまでにマコンブのcDNA発現ライブラリーを用いて、各種多糖を基質として、薄層クロマトグラフィーにより酵素活性のスクリーニングを続けていく。一次構造情報が未知の酵素については、データベースを用いて相同性検索を行うことが困難なため、今後も本法によるスクリーニングを進め、酵素活性を示すクローンの取得を目指す。
カロテノイド生合成関連酵素については、褐藻由来の候補タンパク質は大腸菌での発現レベルが著しく低いことが分かっため、昆虫細胞による活性評価系を構築する。この発現系を用いて大腸菌で可能であったリコペンおよびβ-カロテンの生産を調べ、本システムの妥当性を調べる。これらのカロテノイド生産が可能であった場合には、候補タンパク質を発現する組換えバキュロウィルスを作成し、酵素活性について評価を進める。
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Research Products
(3 results)
