2019 Fiscal Year Annual Research Report
Role of stress-induced transcription factor ATF3 on neurodegeneration of prion diseases
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19H03119
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
堀内 基広 北海道大学, 獣医学研究院, 教授 (30219216)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | プリオン病 / ATF3 / アデノ随伴ウイルスベクター / 神経細胞 / CRISPR/Cas9 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ストレス誘導性の転写調節因子ATF3の発現誘導機構、およびATF3が転写調節する分子群の解析により、プリオン病における神経変性機構の核心に迫れると考え、ATF3の神経細胞特異的ノックダウンを計画した。当初、コンディショナルターゲッティングで神経細胞特異的ATF3を欠損する計画であったが、マウスの遺伝背景の差異が大きいことから、神経組織親和性が高いアデノ随伴ウイルスベクター(rAAV-PHP.eB)を用いて経細胞特異的にCRISPR/SaCas9システムでゲノム編集を行う実験系に切り替えた。Sny1 プロモーター下で神経細胞特異的にSaCas9 を発現し、ATF3に対するguide RNAを発現するアデノ随伴ウイルスベクターrAAV-AFT1, rAAV-AFT2を作成した。陰性対照として、オフターゲット効果がないとされるguide RNAを発現するrAAV-NC1, rAAV-NC2, およびSyn1プロモーター下でEGFPを発現するrAAV-EGFPを作成した。rAAV-EGFPをウイルスベクターを脳定位接種法により接種して接種部位の神経細胞でEGFPが発現することを確認した。また、SaCas9を発現するrAAVを初代培養神経細胞に感染させてSaCas9の発現を確認した。現在、予想したゲノム編集が生じるか検討中である。プリオン感染マウスにおけるATF3陽性細胞の定量解析、ATF3神経細胞の割合、および出現部位を解析するために、プリオン感染マウスの脳凍結切片を、NeuN (神経細胞マーカー) とATF3に対する抗体を用いて蛍光多重染色を実施した。ATF3陽性細胞の出現が顕著な視床でが、ATF3陽性細胞の70%以上がNeuN陽性細胞であった。また視床背外側以外では橋灰白質でも病態の進行に伴いATF3陽性細胞が増加していた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
コンディショナルターゲッティングによる神経細胞特異的なATF3の欠損から、AAVを用いたゲノム編集によるATF3のノックダウンに手法を切り替えたが、rAAVの作製は終了し、ゲノム編集の有無の確認段階まで進んだことから、ほぼ予定通りに進捗していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
脳定位接種法によりプリオン感染マウスにrAAVを視床に接種して、陰性対照rAAV接種群と比較してATF3陽性細胞数の変化を調べる。ATF3陽性細胞数が減少した場合には、生存期間、臨床症状、PrPScの蓄積、ミクログリアの活性化およびアストログリオーシスを評価する。RNA-seqの結果からATF3が発現調節するアポトーシス関連因子 Glutathione Specific Gamma-Glutamylcyclotransferase 1 (Chac1) の発現後進が判明していることから、in situ hybridizationを用いて、ATF3陽性神経細胞にChac1が発現するか確認する。ATF3が免疫細胞で転写調節する遺伝子群に関する報告はあるが、神経細胞内で転写調整する遺伝子群に関する報告はない。神経細胞初代培養を低酸素処理をした場合にATF3の発現誘導が生じることから、この実験系を用いて、クロマチン免疫沈降法を用いて、神経細胞でATF3が発現調節する遺伝子群の同定を試みる。
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Research Products
(9 results)
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[Journal Article] Tracking and clarifying differential traits of the classical- and atypical L-type bovine spongiform encephalopathy prions after transmission from cattle to cynomolgus monkeys2019
Author(s)
Hagiwara, K., Yuko Sato, Y., Yamakawa, Y., Hara, H., Tobiume, M., Okemoto-Nakamura, Y., Sata, T., Horiuchi, M., Shibata, H., Ono, F.
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Journal Title
PLoS One
Volume: 14
Pages: e0216807
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] The first isolation and identification of canine parvovirus (CPV) type 2c variants during 2016 - 2018 genetic surveillance of dogs in Mongolia.2019
Author(s)
Uyangaa Temuujin, Ariunaa Tserendorj, Jumpei Fujiki, Yoshihiro Sakoda, Erdene-Ochir Tseren-Ochir, Masatoshi Okamatsu, Keita Matsuno, Tumenjargal Sharav, Motohiro Horiuchi, Takashi Umemura, Tungalag Chultemdorj.
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Journal Title
Infect. Genet. Evol.
Volume: 73
Pages: 936-942
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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