2021 Fiscal Year Annual Research Report
概日時計調節化合物の新規標的探索法の開発と周期・位相制御機構の解明
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19H03178
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
大川 妙子 (西脇妙子) 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (30432230)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 概日時計 / ゲノムワイドノックアウトスクリーニング / ケミカルバイオロジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
概日時計調節化合物の標的を探索するために、細胞レベルで遺伝学的手法によるスクリーニングの系の確立を目指した。当該年度は遺伝学的スクリーニングの系を用いてパイロットスクリーニングを行った。ヒト2倍体細胞株hTERT-RPE1に、レンチウイルスベクターを用いてプール型ゲノムワイドノックアウトライブラリーを導入し、Puromycin耐性を指標にライブラリーが導入された細胞を選抜した。その後384 well plateにおおよそ1 colony/wellになるよう播種した。細胞を十分に増殖させた後、デキサメタゾン刺激によりリズムのリセットを行い、時計遺伝子Bmal1のルシフェラーゼレポーターを用いた発光測定によりリズムを測定した。化合物を添加していない状態で約2000 クローンをスクリーニングしたところ、リズムの周期が有意に変化しているもの、デキサメタゾン刺激に対して、正常な細胞と異なる応答を示すものなど数個のクローンが得られた。これらのクローンについては、ゲノムPCRとシーケンス解析により導入されたsgRNA配列を特定することができた。今後は、この系を用いて概日時計調節化合物に対する応答性の異なるクローンをスクリーニングすることにより、これまでに得られている周期短縮作用を持つ化合物、および周期延長作用を持つ化合物の標的探索を行う予定である。
この系は新規概日時計遺伝子のスクリーニングにも利用できる。これまで哺乳類の概日時計遺伝子は、変異原処理を行ったマウスを用いて個体レベルで優性の形質を示す遺伝子が探索されてきたが、本手法はこれと比較して明らかにスループットが高いため、新たな遺伝子の発見が期待される。
また周期延長、および短縮効果を持つ化合物については、従来のアフィニティ精製と本手法の両面から標的同定を進める予定である。
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| Research Progress Status |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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[Journal Article] Modulation of circadian clock by crude drug extracts used in Japanese Kampo medicine2021
Author(s)
Zhang M, Kobayashi K, Atsumi H, Katada Y, Nakane Y, Chen J, Nagano R, Kadofusa N, Nishiwaki-Ohkawa T, Kon N, Hirota T, Sato A, Makino T, Yoshimura T.
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Journal Title
Sci Rep.
Volume: 11
Pages: 21038
DOI
Peer Reviewed
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