2020 Fiscal Year Annual Research Report
定量キラルメタボロミクスを実現する三次元LC分析基盤開発と腎・心不全の早期診断
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19H03359
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
濱瀬 健司 九州大学, 薬学研究院, 教授 (10284522)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
秋田 健行 九州大学, 薬学研究院, 助教 (50294963)
猪阪 善隆 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (00379166)
木村 友則 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所, 医薬基盤研究所 難治性疾患研究開発・支援センター, センター長 (00631300)
井手 友美 九州大学, 医学研究院, 准教授 (90380625)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 分析化学 / 光学分割 / 多次元HPLC / 定量メタボロミクス / アミノ酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では腎不全・心不全の新規低侵襲早期診断法として、血中および尿中のキラルメタボロームプロファイリングを利用した方法を開発する。2020年度は2019年度までに親水性アミノ酸の分析装置を開発したことをうけ、分析対象に哺乳類体内でD体が認められる各種アミノ酸を加えると共に、乳酸、3HB以外の各種ヒドロキシ酸もターゲットに加えた。なお、各次元に利用する固定相は表面状態を制御することで移動相適合性の問題を解決し、選択性と感度の両立を実現した。
キラルメタボローム三次元HPLC分析装置の開発に関しては、これまで多次元化が困難であった酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、分岐鎖アミノ酸をターゲットとする三次元HPLC分析システムを開発した。分析法は一次元目の逆相、三次元目のキラル分割に加えて二次元目に陰イオン交換またはミックスモード分離を有する三次元LC/LC/LC装置とした。一次元目、二次元目、三次元目ともに固定相は全て自作し、各次元の保持力を制御することで移動相適合性の問題を解決し、定量性、選択性、理論段数の向上を図った。特に酸性アミン酸、塩基性アミノ酸分析装置としては、アニオン、カチオンの三次元分析を行うために二次元目となるミックスモード分離カラムについて表面修飾を制御した新規カラムの設計・作製を行い、良好な分離を達成した。分岐鎖アミノ酸では同重体となるロイシン連鎖異性体の一斉分析を可能とする三次元目分離カラムの設計・作製に成功した。ヒドロキシ酸についてもこれまで対象としていた乳酸、3-ヒドロキシ酪酸に加え、2-ヒドロキシ酪酸、リンゴ酸を分析対象とする二次元HPLC装置の開発を行った。
また、2021年度に予定している様々な腎・心不全検体を用いるキラルメタボロームプロファイリングを行う準備として、大阪大学医学部腎臓内科、九州大学医学部循環器内科と共同で腎不全、心不全検体の収集を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
アミノ酸の三次元HPLC分析システムとしては2019年度までに実現していた腎機能の有用なマーカーであるアスパラギン、セリン、アラニン、プロリン分析システムに加え、2020年度はこれまで困難であった酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、分岐鎖アミノ酸の三次元HPLC分析システムの構築を達成している。また、ヒドロキシ酸についても、乳酸、3-ヒドロキシ酪酸に加えて2-ヒドロキシ酪酸、リンゴ酸鏡像異性体をターゲットとする二次元システム構築を達成している。各種モデル動物の作出、ヒト検体の収集も進んでいる。以上より本研究は概ね順調に進んでいると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
2021年度は分析対象をタンパク質構成全アミノ酸に拡大し、三次元HPLC分析法を構築して哺乳類体内におけるD体の存在を検討する。また、アミノ酸、ヒドロキシ酸に加えて各種ペプチドもターゲットとする。なお、各次元に利用する固定相は理論段の更なる向上を実現することで高性能化を図る。また、原因疾患の異なる腎不全・心不全検体を用いてキラルプロファイリングによる原因疾患の鑑別を試みると共に、含量変化の生理的意義を解析する。
キラルメタボローム三次元HPLC分析装置の開発に関しては、これまで多次元化が困難であったトリプトファン、チロシン、システインをターゲットとする三次元HPLC分析システムを開発する。分析法は一次元目の逆相、三次元目のキラル分割に加えて二次元目に陰イオン交換またはミックスモード分離を有する三次元LC/LC/LC装置とする。トリプトファンは蛍光検出感度が極めて低いため、インドール環の開裂によるクエンチング解消を試みて高感度三次元HPLCシステムを開発する。チロシンについては多重標識による感度と溶解性の低下を解決し、システインについては酸化還元の制御を行って高選択的三次元HPLCシステムを開発する。
また、確実に原因疾患が特定されている腎・心不全試料を大阪大学医学部腎臓内科、九州大学医学部循環器内科と共同で収集し、キラルメタボロームのプロファイリングを行う。腎不全としては、糸球体腎炎、糖尿病性腎症などを選択する。心不全としては心筋梗塞、拡張型心筋症などの分析を試み、キラルアミノ酸およびキラルヒドロキシ酸のプロファイリングと疾患との関連を解析する。
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[Journal Article] Determination of phenylalanine enantiomers in the plasma and urine of mammals and D-amino acid oxidase deficient rodents using two-dimensional high-performance liquid chromatography2021
Author(s)
Sui-Wen HSIAO, Chiharu ISHII, Aogu FURUSHO, Chin-Ling HSIEH, Yukiko SHIMIZU, Takeyuki AKITA, Masashi MITA, Tadashi OKAMURA, Ryuichi KONNO, Tomomi IDE, Ching-Kuo LEE, Kenji HAMASE
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Journal Title
Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics
Volume: 1869
Pages: 140540
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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