2020 Fiscal Year Annual Research Report
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19H03370
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
岡 昌吾 京都大学, 医学研究科, 教授 (60233300)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森瀬 譲二 京都大学, 医学研究科, 助教 (60755669)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | AMPA受容体 / N型糖鎖 / HNK-1糖鎖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、シナプス可塑性の制御に中心的な役割を担うイオンチャネル型グルタミン酸受容体（特にAMPA受容体）の様々なトラフィッキング過程において、受容体上のN型糖鎖の機能的役割を明確にし、シナプス可塑性制御機構の総合的理解を目指すことを目的としている。
前年度の研究においてAMPA受容体の主要なサブユニットであるGluA1やGluA2の糖鎖付加部位変異体を用いた解析により、GluA1のN63とN363位およびGluA2のN370位の３つの糖鎖が細胞表面発現に重要な役割を担うことが明らかとなった。そこでこれら３つの糖鎖の細胞発現調節機構の違いを明確にするため、それぞれの糖鎖付加部位変異体と野生型とを組み合わせて発現させ、その細胞表面発現量の変化を解析した。その結果、GluA1 N63の糖鎖付加部位変異体は野生型のGluA1やGluA2と共発現させても細胞表面量の抑制は解除されず、むしろ野生型のGluA1表面発現量を低下させることが明らかとなった。GluA1 N363の変異体はGluA2の野生型により細胞表面発現量は回復するものの、GluA1の野生型では回復が見られなかった。また、野生型GluA1の表面発現量には影響を与えなかった。GluA2 N370の変異体はGluA2の野生型により細胞表面発現量は回復し、GluA1の野生型では回復が見られなかった。また、野生型のGluA1表面発現量を低下させることが明らかとなった。以上のことからそれぞれの糖鎖は異なる表面発現調節を行っていることが示された。さらに、細胞の表面からの取り込みとその後のトラフッキングに関しては、京都大学の浜地博士らが開発したAMPA受容体特異的ラベル化剤を用いて、まず野生型GluA2をラベル化する条件の検討を行い、０時間から８時間までの細胞内への取り込みを追跡することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究概要に記述したAMPA受容体の細胞内から細胞表面への輸送における各糖鎖の機能的な相違点については、宮崎大学の高宮教授との共同研究として今年度論文にまとめることができた。したがって概ね順調に実験は進捗していると考えられる。しかしこの手法を用いて解析する過程で、細胞表面への輸送に影響が生じた糖鎖の細胞表面上での機能解析が難しいことが痛感された。そこで細胞表面上に発現する糖タンパク質糖鎖機能を直接解析するために、新たな解析法を考案した。細胞を培養している培地中に糖鎖遊離酵素を添加することにより特定の糖鎖を遊離させ、それに伴い引き起こされる細胞の機能変化を解析しようと考えた。具体的には初代培養神経細胞を用い、まず、糖鎖遊離酵素を細胞培養培地に添加し、細胞表面タンパク質糖鎖に作用させるための条件として、培地中への添加量と細胞表面タンパク質糖鎖が切断されるかどうかを検討した。糖鎖遊離酵素としてhigh-mannose型糖鎖を切断するEndo HおよびすべてのN型糖鎖を切断するPNGase Fを用いて実験を行った。その結果、神経細胞にダメージを与えない量の酵素を24時間添加することにより、細胞表面の糖タンパク質糖鎖のごく一部のN型糖鎖が切断されることや、それに伴いスパイン密度の減少や神経突起伸長の抑制が有意に引き起こされることがわかった。それぞれの糖鎖遊離酵素で処理した神経細胞の膜表面タンパク質を回収し、質量分析とを組み合わせることにより、特定の糖タンパク質上の特定のN型糖鎖がスパインの形成などの関与している可能性を見出しつつある。以上のことから全体を通して進捗状況としては概ね順調であると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
NMDA型グルタミン酸受容体は、AMPA型グルタミン酸受容体とともにシナプス可塑性制御に関わる重要なイオンチャネル型グルタミン酸受容体である。NMDA受容体は主にGluN1、GluN2A、GluN2Bと呼ばれるサブユニットの四量体から形成される。中でもGluN1は全てのNMDA受容体に含まれる必須のサブユニットである。一般的な糖タンパク質は、小胞体内でhigh-mannose型糖鎖が付加された後、ゴルジ体でプロセシングを受けることにより、complex型糖鎖を持つようになる。一方、GluN1は分子内に多くの糖鎖付加部位が存在するにも関わらず、細胞表面への輸送後も、その全てがhigh-mannose型糖鎖であることがわかっている。そこでGluN1上のhigh-mannose型糖鎖がNMDA受容体機能にとってどのような役割があるかを解析する。
HNK-1糖鎖はシナプス可塑性調節に重要な役割を担う。本糖鎖は、同一神経細胞に発現しているはずのNMDA受容体には発現せず、またAMPA受容体のなかでもGluA2に特異的に発現し、AMPA受容体の細胞表面発現量を調節する役割を有していることがすでに明らかになっている。またHNK-1糖鎖はN型糖鎖の中でもcomplex型糖鎖末端に存在するがラクトース残基にグルクロン酸が付加される特徴を持つ。本研究によりAMPA受容体の主要な構成成分であるGluA1とGluA2の糖鎖構造解析を行い、GluA1にもGluA2同様complex型糖鎖をその分子内に持つことが明らかとなった。そこで、GluA1には発現せず、GluA2特異的にHNK-1糖鎖が発現する機構に関してHNK-1糖鎖生合成酵素を中心に解析する。
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| Remarks |
http://oka-lab.hs.med.kyoto-u.ac.jp/index.html
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