2019 Fiscal Year Annual Research Report
Identification of host genes that regulate neutralizing antibody production upon retrovirus infections and their mechanisms of action
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19H03481
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
宮澤 正顯 近畿大学, 医学部, 教授 (60167757)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
博多 義之 近畿大学, 医学部, 講師 (30344500)
塚本 徹雄 近畿大学, 医学部, 助教 (80750223)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | APOBEC3 / レトロウイルス / 宿主因子 / 中和抗体 / Bリンパ球 / 胚中心 / 骨髄 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ウイルス中和抗体産生制御機構の解明は、感染防御ワクチン開発に必須である。我々と米国のSantiagoらは、マウスレトロウイルス感染時に中和抗体産生を制御する宿主遺伝子を同定する過程で、独立かつ同時に、APOBEC3の系統間多型を発見した。APOBEC3は生体内でレトロウイルス複製過程を直接制限し、C57BL/6（B6）系統の持つ対立遺伝子の産物は、レトロウイルス感染及び発病に対する強い抵抗性を賦与する。しかし、細胞質内に発現し、粒子内に取り込まれてウイルス複製過程を阻害するAPOBEC3が、中和抗体産生制御因子として機能するしくみは明らかでない。
本研究では、①APOBEC3はBリンパ球の核内に局在し、免疫グロブリン遺伝子可変部の体細胞高頻度突然変異を誘導する； ②APOBEC3は、ウイルス抗原特異的受容体を持つBリンパ球を感染による細胞傷害から保護する； ③ウイルス中和抗体産生制御遺伝子はAPOBEC3と連鎖する別の遺伝子であり、背景遺伝子との相互作用のため正しくマップされていなかったが、コンジェニックマウスの退交配により新たに同定可能である、という３つの実行可能な仮説を検証している。
2019年度は、CRISPR-Cas9系を用いた受精卵へのノックインによって、APOBEC3分子N-末端にin-frameでFLAGタグを挿入したB6マウス系統を樹立し、発現量の高いホモ接合個体を多数得た。これらを用いて、各組織におけるAPOBEC3分子の生理的発現を解析し、骨髄ではBリンパ球前駆細胞の一部に、また脾臓では白脾髄の胚中心細胞に、特にAPOBEC3タンパク質の発現が高いことを見出した。また、試験管内でLPS刺激を加えたBリンパ球の共焦点レーザー顕微鏡による解析で、APOBEC3は主に細胞質に局在するが、一部は核に分布する可能性が示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初の計画では、2019年度中にFALGタグノックインAPOBEC3発現マウス系統を確立し、交配維持することになっていたが、既にFLAG標識APOBEC3を高発現する3つの系統を樹立して、そのホモ接合個体を複数維持・増産している。また、組織学的な解析法として凍結切片またはホルマリン固定パラフィン切片のチラミド増感による蛍光免疫組織化学法、および酵素抗体二重染色法を確立、脾臓では白脾髄の胚中心にAPOBEC3が高発現することを発見した。また、免疫系以外の組織での意外な程高いAPOBEC3タンパク質発現を発見し、これについては当該組織の病態に詳しい専門家との共同研究を開始している。
細胞レベルでの発現と細胞内局在については、分離したBリンパ球を試験管内でLPSにより刺激した後、共焦点レーザー顕微鏡による観察、および生化学的な細胞分画法による解析を行った。これにより、Bリンパ球ではAPOBEC3タンパク質が主に細胞質に局在していること、核に僅かに分布するとしても、その局在は核膜直下であることが示された。
これらの成果は、既に第31回のレトロウイルス病因論国際ワークショップ（イタリア・パドヴァ）において口頭発表済みであり、これを聴いたドイツ・デュースブルク＝エッセン大学ウイルス研究所のWibke Bayer博士より、蛍光タンパク質を発現するフレンドウイルスの供与を受けて、ウイルス感染時のAPOBEC3タンパク質発現変動と、感染細胞におけるAPOBEC3局在変化に関する共同研究を開始している。
また、APOBEC3がそのシチジンデアミナーゼ活性を介して免疫グロブリン遺伝子可変部の体細胞高頻度突然変異に関与する可能性については、イリノイ大学シカゴ校のSusan Ross教授より、デアミナーゼ活性を失わせたAPOBEC3分子を発現するマウス系統に供与を受け、既に交配維持を開始している。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記の進捗を受けて、2020年度は以下の解析を推進する：
１）FLAG標識APOBEC3発現マウスの骨髄および脾臓細胞を分離し、前者についてはSca-1, Kit, CD19を含む多重マーカー、後者についてはCD19, CD21, CD23, B220, CD93, GL-7を含む多重マーカーで蛍光セルソーター解析を行い、生理的にAPOBEC3を高発現する細胞集団を同定する。また、組織切片を用いた多重免疫染色を実施し、APOBEC3タンパク質の組織局在と、レトロウイルス感染時の変化を経時的に解析する。
２）FALG標識APOBEC3発現B6マウスに、蛍光タンパク質発現フレンドウイルス複合体を高い感染価で接種する。その後時間経過を追って骨髄と脾臓を採取し、１）と同様の蛍光セルソーター解析により、フレンドウイルス感染に伴うAPOBEC3発現量と細胞分布の変化を追うと共に、特に感染Bリンパ球においてAPOBEC3の発現量と細胞内局在が変わる可能性を検討する。
３）APOBEC3が、免疫グロブリン可変部の高頻度突然変異を介してウイルス中和抗体産生に関与するなら、それにはデアミナーゼ活性が必須の筈である。そこで、デアミナーゼ活性欠損APOBEC3を発現するB6マウスにフレンドウイルスを感染させ、経時的に血清を採取してウイルス中和抗体価を測定する。
４）免疫系以外の組織で意外な程高発現するAPOBEC3タンパク質の機能を解明するため、その組織の病態、特に炎症誘発時の遺伝子発現変化や腫瘍発生に詳しい専門家と共同し、APOBEC3タンパク質のこれまで全く予想されていなかった生理機能を明らかにしていく。
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