2020 Fiscal Year Annual Research Report
Identification of liver cancer stem cell-like clones causing treatment resistance by cancer evolution
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19H03637
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| Research Institution | University of Fukui |
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Principal Investigator |
中本 安成 福井大学, 学術研究院医学系部門, 教授 (40293352)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平松 活志 福井大学, 学術研究院医学系部門(附属病院部), 准教授 (30646849)
野阪 拓人 福井大学, 学術研究院医学系部門, 助教 (70748441)
山下 太郎 金沢大学, 附属病院, 准教授 (90377432)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 肝細胞がん / がん幹細胞 / 循環腫瘍細胞 / シングルセル解析 / 創薬シーズ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、肝がん患者において治療耐性を誘導するがん幹細胞様クローンを同定するとともに制御法を開発することを目的としている。そこで、肝がん患者の分子標的治療や化学療法中に、血液中の循環腫瘍細胞（CTC）を液体生検し、CTCのシングルセル解析からがん幹細胞様クローンの特性について検討した。
１）肝がん患者末梢血からのCTC液体生検： 令和元年度までに、患者末梢血を溶血処理後に、細胞用フィルター（ScreenCellTM）と遠心法を用いてCTCを回収する方法を確立して、最先端のセルソーター技術を組み合わせるによってシングルセルレベルで解析、分取することが可能となっている。
２）シングルセル解析～がん幹細胞様クローンの選択： セルソーターでの解析において、多重蛍光染色を行うことにより、肝がん患者の末梢血CTC単一細胞の様々な特性を解析した。肝がん患者21名に対する各種治療（Atezolizumab＋Bevacizumab/ TACE/ Lenvatinib/ HAIC）の経過においては、進行期肝がんの治療前末梢血に認めたCK(+)CD45(-)CTC細胞数が有意に減少することが分かった（P <0.01）。CTCサブタイプ解析においては、幹細胞マーカー（EpCAM, Vimentin, CD90, CD133）の中でCD133(+)細胞分画が減少した。これに対して、CTC遺伝子発現解析では、治療に伴って他の幹細胞マーカー(OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC、SALL4、EpCAM)の発現が上昇していた。
これより、治療経過に伴うCTC幹細胞マーカーの変化から、治療抵抗性CTCの分子細胞学的特徴が示唆され、腫瘍形成能や転移能をもったがん幹細胞様クローンの特性を考察する上で意義深い成果と考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究において、令和元年度～令和2年度は１）－２）が計画されていた。ほぼ予定通りに進捗しており、３年計画の最終の令和3年度に向けて、３）がん幹細胞性を誘導する責任遺伝子の機能的スクリーニングがすでに開始されている。おおむね順調に進展しているものと考えられ、３-a）として継続中の計画は以下のごとくである。
３）がん幹細胞性を誘導する責任遺伝子の機能的スクリーニング： ２）において選択された責任候補遺伝子について、以下の機能的な検討を行う。
a. in vitro評価系： 肝がん細胞株（HepG2,HuH7, Hep3B等）に候補遺伝子のsiRNA/shRNAライブラリー（384遺伝子siGENOMETM）やゲノム編集CRISPR/Cas9系を用いてEMTや幹細胞性の誘導を観察する。a-1) EMT誘導能：EMTマーカーの発現変化をRNA(PCR法)や蛋白(ELISA)にて検討する。a-2) 薬剤耐性、アポトーシス：分子標的薬、化学療法薬の濃度変化による細胞死をCell Counting Kit-8やTUNEL、Annexin Vにて定量する。a-3) 細胞増殖：MTSアッセイ、ソフトアガ－法、コロニー形成、スフェロイド形成。a-4) 浸潤活性：Matrigel-coated 8.0 μm filterチャンバー。a-5) 細胞周期：propidium iodide（PI）染色、cyclin D1・CDK発現；Western Blot法。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画通り、１）－２）に加えて３-a）が進展しており、今後は以下の３-b）の研究を予定している。
３）がん幹細胞性を誘導する責任遺伝子の機能的スクリーニング： ２）において選択された責任候補遺伝子について、以下の機能的な検討を行う。
b. in vivo評価系(非臨床試験)： 肝がん転移モデルを用いる。b-1) 肝がん転移モデル：申請者らは肝がん細胞株（BNL、Hepa1-6等）を同系マウス（BALB/c、C57BL/6）の尾静脈、門脈あるいは脾臓に注入することによって、肝臓、肺への転移系を確立している。b-2) 候補遺伝子の操作：合成アンチセンスオリゴ、siRNA、RNA aptamerを導入して遺伝子発現をノックダウンする手法が開発されている。b-3) がん転移の制御能評価：マーカー遺伝子GFPを導入した肝がん細胞株を投与後、１週間ごとに肝臓、肺にみられる転移巣の数とサイズを定量する。GFP蛍光によりがん細胞株を生体内で追跡することが可能である。
これより、１）２）で選択されたがん幹細胞様クローンの責任候補遺伝子について、３）での幹細胞性の誘導能が検証されたものは新たな創薬シーズとして提案する。
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[Journal Article] Sofosbuvir plus velpatasvir treatment for hepatitis C virus in patients with decompensated cirrhosis: a Japanese real-world multicenter study.2021
Author(s)
Tahata Y, Hikita H, Mochida S, Kawada N, Enomoto N, Kanto T, Suda G, Nakamoto Y, Kato N, Asahina Y, Matsuura K, Terai S, Nakao K, Shimizu M, Takami T, Akuta N, Yamada R, Kodama T, Tatsumi T, Yamada T, Takehara T, et.al.
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Journal Title
J Gastroenterol.
Volume: 56(1)
Pages: 67-77
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Circulating tumor cells detected with a microcavity array predict clinical outcome in hepatocellular carcinoma.2021
Author(s)
Takahashi K, Ofuji K, Hiramatsu K, Nosaka T, Naito T, Matsuda H, Endo K, Higuchi M, Ohtani M, Nemoto T, Nakamoto Y.
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Journal Title
Cancer Med.
Volume: 10(7)
Pages: 2300-2309
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Serum laminin gamma2 monomer as a novel diagnostic and predictive biomarker for hepatocellular carcinoma.2021
Author(s)
Yamashita T, Koshikawa N, Shimakami T, Terashima T, Nakagawa M, Nio K, Horii R, Iida N, Kawaguchi K, Arai K, Sakai Y, Yamashita T, Mizukoshi E, Honda M, Kitao A, Kobayashi S, Takahara S, Imai Y, Yoshimura K, Murayama T, Nakamoto Y, Yoshida E, Yoshimura T, Seiki M, Kaneko S.
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Journal Title
Hepatology.
Volume: -
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Daily Usage of Proton Pump Inhibitors May Reduce the Severity of Critical Upper Gastrointestinal Bleeding in Elderly Patients.2020
Author(s)
Matsuda H, Nosaka T, Akazawa Y, Saito Y, Ozaki Y, Takahashi K, Naito T, Ofuji K, Ohtani M, Hiramatsu K, Nakamoto Y.
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Journal Title
Gastroenterol Res Pract.
Volume: 2020
Pages: 7168621
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Safety and Long-Term Outcome of Intratumoral Injection of OK432-Stimulated Dendritic Cells for Hepatocellular Carcinomas After Radiofrequency Ablation.2020
Author(s)
Kitahara M, Mizukoshi E, Terashima T, Nakagawa H, Horii R, Iida N, Arai K, Yamashita T, Sakai Y, Yamashita T, Honda M, Nakamoto Y, Kaneko S.
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Journal Title
Transl Oncol.
Volume: 13
Pages: 100777
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Bipolar-current needle-knife with a water jet function (Jet B-knife) shortens the procedure time of endoscopic submucosal dissection for colorectal tumors.2020
Author(s)
Hiramatsu K, Naito T, Akazawa Y, Saito Y, Nosaka T, Takahashi K, Ofuji K, Matsuda H, Ohtani M, Matsuda M, Sakai A, Nakamoto Y.
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Journal Title
Surg Endosc.
Volume: -
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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