2019 Fiscal Year Annual Research Report
Novel therapy for nephotic syndrome targetting synapse associated molecules in podocyte
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19H03673
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
河内 裕 新潟大学, 医歯学系, 教授 (60242400)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
葛谷 聡 京都大学, 医学研究科, 准教授 (30422950)
福住 好恭 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (20609242)
松井 克之 帝京大学, 医学部, 教授 (20256027)
張 エイ 新潟大学, 医歯学系, 助教 (00529472)
安田 英紀 新潟大学, 医歯学系, 助教 (00806490)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 蛋白尿 / ネフローゼ症候群 / ポドサイト / スリット膜 / Neurexin / EphrinB1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
各種シナプス関連分子（synaptic vesicle protein 2B (SV2B)、Neurexin、Ephrin-B1）が腎糸球体上皮細胞（ポドサイト）に発現していること、その分子機能の低下が蛋白尿発症に関与していることを明らかにしてきた。今年度は、Neurexin についての検討を中心に行った。Neurexinは各種分子型が存在するが、Neurexin1αがポドサイト障害発症時に発現が低下し、局在変化が著明であることを確認したためNeurexin1αKOマウスを確立した。Neurexin1α KOマウスは全身のKOマウスにおいても致死とならないとの報告があるため、Neurexin1α KOマウスを作製し、腎、その他臓器における表現型の解析を進めた。ヘテロマウス同士の交配で得られたNeurexin1α KOマウスの出生率は約10％で有意に低かった。得られたKOマウスは野生型マウスと比較して有意に小さく体重が軽かった。 KOマウス腎糸球体では、スリット膜機能分子であるNephrin、CD2AP、ZO-1、Ephrin-B1の染色強度が低下していた。一方で、Podocin、NEPH1、Synaptopodin、Podocalyxin染色の明確な変化は観察されなかった。またNeurexin1αとスリット膜機能分子との相互作用の検討を行い、Neurexin1αはCD2APだけでなくNephrinとも親和性を持つことをHEK293細胞強制発現系での検討で明らかにした。
SV2Bは研究代表者らが蛋白尿発症に重要な役割を果たしていることを示した分子で、SV2Aなど他のシナプス小胞関連分子に比べ神経領域での検討は進んでいなかった。分担者はSV2Bがアルツハイマー病の発症に関与していることを報告した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度はNeurexin についての検討を中心に行った。Neurexin1α KOマウスの確立を企図し、ヘテロマウスを移入し、交配を行った。これまでの報告ではNeurexin1α KOマウスは全身のKOマウスにおいても致死とならないとされていたが、ヘテロマウス同士の交配で得られたNeurexin1α KOマウスの出生率は約10％で有意に低く、出生時体重が軽かった。この観察はNeurexin1α機能を検討する上で重要な知見と考えている。交配ペアを増やすことによりKOマウス数を確保し、腎での表現型の検討を進めることができた。Neurexin1α KOマウスでは、蛋白尿発症に関わるスリット膜関連分子の発現、局在が著明に変化していることを明らかにした。一連の検討で、Neurexin1αの機能低下がスリット膜障害、蛋白尿発症に重要な役割を果たしていること、蛋白尿抑制治療薬の標的として有用であることを示した。また、各種Neurexin variantsのHEK293細胞強制発現系を確立し、Nephrinなど各種スリット膜機能分子との相互作用の検討を進めた。また、Neurexinの検討に並行して、本研究課題で主な治療標的候補分子として提示したSV2B, Ephrin-B1の分子機能についての検討も進め、それぞれ神経内科領域、病理学領域の重要雑誌に報告した。
以上より、本研究課題は当初の計画通り、順調に進展していると考えた。
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| Strategy for Future Research Activity |
Neurexin1α KOマウスの腎における形態、機能変化についての検討をさらに進める。またHEK293細胞での強制発現系を用いて、既知のスリット膜機能分子との構造的、機能的相互作用の検討を進める。また、Neurexinに修飾作用を持つ化合物を用いた検討を進める。
今年度は、Neurexinに関する研究に並行して、Ephrin-B1の検討を進める。具体的な検討課題は、①RNA-seq法を用いてEphrin-B1 KOマウス糸球体で発現が変化している分子の探索を進め、Ephrin-B1の細胞質部での関連分子を同定し、Ephrin-B1を介したシグナル伝達機構の解明を進める。同法で得られたEphrin-B1関連分子（候補分子）の発現、局在解析を行う。また、HEK細胞を用いた強制発現系を用いた解析でEphrin-B1との結合性、機能的相互作用（Ephrin-B1リン酸化による変化）の検討を行う。②これまでの検討でEphrin-B1がその制御に関わっていると考えられているJNKリン酸化とスリット膜障害との関連についての検討を進める。具体的にはラットポドサイト障害モデルを用い、ポドサイト障害、Ephrin-B1の発現変化に対するJNK阻害剤の効果の検討を行う。③臨床応用に向けた取り組みとして、ネフローゼ症候群の予後鑑別、病勢理解につながる新規診断法の開発のための標的分子としてのEphrin-B1の有用性の検討を行う。各種ネフローゼ病態モデルの腎組織、尿材料での発現を経時的に解析し、病態との関連についての検討を行う。
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