Development of a new Regenerative Medical Treatment using the cerebrum anlage derived from Muse cells in oral mesenchymal tissue

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19H03767
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 沖 明典 筑波大学, 医学医療系, 教授 (60334067)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石川 博 筑波大学, 医学医療系, 研究員 (30089784) ; 丸島 愛樹 筑波大学, 医学医療系, 講師 (40722525) ; 松丸 祐司 筑波大学, 医学医療系, 教授 (70323300) ; 豊村 順子 筑波大学, 医学医療系, 研究員 (80645630) [Withdrawn] ; 松村 明 筑波大学, 医学医療系, 教授 (90241819) ; 大山 晃弘 筑波大学, 医学医療系, 研究員 (90538232) [Withdrawn]
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 歯髄幹細胞 / 天蓋培養 / 胚様体 / 還流培養 / 胚子様構造体 / 各種器官・臓器の原基

Outline of Annual Research Achievements

我々は今までヒト歯髄幹細胞からフェノタイプが非常に安定した神経系細胞を分化誘導することに成功し,これをパーキンソンモデル動物の内側前脳束に移植し症状の改善を確認した（Tahashi H, et al. Human Cell 2017；AMED 2019?）。また、歯髄細胞から約７日間で神経系細胞に分化誘導することにも成功している（AMED 2019, 特開－　　）。これらの神経系細胞を用いて（１）脳梗塞モデル動物の梗塞部に直接移植し機能の回復を評価している。また、（２）分化誘導神経系細胞から血管内在神経束を作製し、末梢神経損傷、脊髄損傷のモデル動物に移植し、機能回復を確認している（DSANJ 2019）。一方、再生医療に用いられる細胞源としてiPS細胞、ES細胞そして組織（体性）幹細胞がある。再生医療では、これら幹細胞を目的の細胞に分化誘導して、機能不全に陥った器官・臓器に移植するが、分化誘導した細胞は、1種類の細胞であることが多い。一方、機能不全に陥っている器官器・臓器は多種類の細胞で構成されている。したがって移植後の機能改善は不十分であることが多い。移植後、正常に近い機能を回復させるには、器官・臓器を構成する細胞をone set移植する必要がある。そこで、幹細胞が多く存在する歯髄から幹細胞を分離し、これを天蓋培養して胚葉体を製作し、これを還流培養で成育させて胚子様構造体を作製する。胚子様構造体内には器官・臓器の原基が存在しているので、これらを採取すれば各種の器官・臓器の構成細胞をone set得ることができる（発明届提出、2020）。これを培養下に増殖させ、機能不全に陥った器官・臓器に移植し、正常に近い機能を回復させることを考えた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ヒト歯髄幹細胞（1x10^5/75μl）をシャーレの蓋に滴下し天蓋培養すると、dropletsの約25%に胚盤胞に似たいわゆる胚様体が観察される。この胚様体をピペットで採取し、ローズのチャンバーに入れ、embryo growth factor (EmbGF：特許準備中)を添加したDMEM/F12培養液で還流培養する。Dropletsの約５％が心拍動する胚子様構造体（1~1.5cm）に成育した。この胚子様構造体内には、原始中枢神経（神経管）（脈絡叢を含む）、心臓原基（１心房1心室、その境に弁膜存在）、肝臓、膵ラ島（原始腸管から芽出）、胎児性軟骨、骨、消化管原基（上皮は単層円柱上皮、）、呼吸器原基（上皮は多列線毛上皮、杯細胞存在）、眼球原基（網膜と色素上皮層）、皮膚（重層扁平上皮、角質層あり、胚芽層より原始毛根芽出）、原始血球、歯胚等が観察された。本年度は以下の研究を行った。（１）神経管を実態顕微鏡下に採取し、細胞をトリプシンーEDTA/PBS(-)で解離し、培養したところ、神経細胞とグリア細胞の幹細胞、神経細胞、星状膠細胞（アストロサイト）、希突起膠細胞（オリゴデンドログリア）、マイクログリアが増殖した。次に（２）ラ島を採取し免染したところ、α（グルカゴン）細胞、β（インスリン）細胞、γ（ソマトスタチン）細胞が存在していた。このラ島を糖尿病モデルマウスの腎被膜下に移植したところ血糖は低下した。移植後120日目に移植した側の腎臓を摘出したところ血糖値は直ちに上昇し、移植前の値に戻った。長期間血糖が正常に経過したことは、移植ラ島内のα、β、γ細胞が互いにパラクリン的に作用しあって血糖を調節したものと思われる（特許準備中）。（３）心臓の原基からは自動拍動する心筋細胞、内皮細胞、刺激伝導系細胞が採取できた。

Strategy for Future Research Activity

（１）神経管を実態顕微鏡下に採取し、細胞をトリプシンーEDTA/PBS(-)で解離し、培養したところ、神経細胞とグリア細胞の幹細胞、神経細胞、星状膠細胞（アストロサイト）、希突起膠細胞（オリゴデンドログリア）、マイクログリアが増殖した。今後、このマイクログリアを用いてMSの研究を行う予定である。また、神経細胞とグリア細胞の幹細胞を用いて分化様式の研究を行う。また、採取した神経管を脳梗塞モデル動物の梗塞部に移植することを計画している。次に（２）胚子様構造体からラ島を採取し免染したところ、α（グルカゴン）細胞、β（インスリン）細胞、γ（ソマトスタチン）細胞が存在していた（特許準備中）。このラ島を糖尿病モデルマウスの腎被膜下に移植したところ血糖は低下した。移植後120日目に移植した側の腎臓を摘出したところ血糖値は直ちに上昇し、移植前の値に戻った。長期間血糖が正常に経過したことは、移植ラ島内のα、β、γ細胞が互いにパラクリン的に作用しあって血糖を調節したものと思われる。そこで、今後は、大型の糖尿病モデル動物を使用して、胚子様構造体から採取したラ島の移植部位の検討を行いたい。（３）心臓の原基からは自動拍動する心筋細胞、内皮細胞、刺激伝導系細胞が採取できたので、心筋梗塞モデル動物の梗塞への移植方法を検討したい。また、心臓外科の先生と共同研究し、刺激電動系細胞の移植方法について検討したい。（４）胚子様構造体から原始血球を採取し、HWFT細胞をfeeder cellとして培養し、NK細胞への分化を試みたい。このNK細胞の腫瘍細胞抑制効果を確かめたい。すでに本学の石川栄一先生が骨髄細胞をHWFT細胞と共培養し、NK細胞の分化増殖の研究をされている。