2019 Fiscal Year Annual Research Report
オミックス解析を用いた歯根膜発生機構の解明と幹細胞誘導型組織再生技術への応用
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19H03832
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
和田 尚久 九州大学, 大学病院, 教授 (60380466)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
前田 英史 九州大学, 歯学研究院, 教授 (10284514)
友清 淳 九州大学, 大学病院, 講師 (20507777)
祐田 明香 九州大学, 大学病院, 助教 (20814081)
藤井 慎介 九州大学, 歯学研究院, 講師 (60452786)
御手洗 裕美 九州大学, 大学病院, 助教 (60801660)
和田 裕子 九州大学, 歯学研究院, 助教 (70380706)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 歯根膜 / 幹細胞 / 歯周組織再生 / 歯胚 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
歯胚発生期に着目してオミックス解析により歯根膜発生・形成に重要な特異的因子を同定、機能解析することで歯根膜発生機構の一端を解明し、さらに歯根膜発生・形成に重要な同定因子を幹細胞分化制御候補因子として歯根膜細胞への分化誘導能について検討することを目的として研究を進めた。
まず、ヒト歯根膜細胞株を用いて歯根膜細胞が特異的に発現している因子として同定したActa2およびtransgelinについて解析を行った。ヒト歯根膜細胞をTGFbeta刺激するとActa2の発現が上昇することを見出したため、siRNAを用いた発現抑制実験を行ったところ、TGFbeta刺激により発現が上昇するⅠ型コラーゲンのmRNA発現が抑制され、またSircol Collagen assayにてコラーゲン産生の抑制が、Picro-sirius red染色（コラーゲン線維に反応）の低下が認められた。以上のことからActa2が歯根膜細胞によるコラーゲン線維形成に関与している可能性が推察された。一方でtransgelinの抑制実験を行ったところIntegrin betaの発現および細胞接着能が減少したことから、transgelinが歯根膜細胞の細胞接着に関与している可能性が示唆された。
次に、マウス胎生18日齢の臼歯歯胚より、歯胚上皮組織、歯乳頭組織、歯小嚢組織を分離し、各組織のmRNAを回収した。各組織に特異的な遺伝子（keratinやvimentin等）の発現の検討により組織のisolationの確度が高いことを確認したのち、微量RNA-seqにて発現遺伝子の網羅的解析を行った。その結果、各組織に高発現している遺伝子群が検出された。これらの遺伝子群の機能解析を行うために、並行してマウス各組織由来の細胞株樹立を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒト歯根膜細胞におけるSemaphorin3AやWntのシグナル解析が進めていく予定であったが、因子を変更しTGFbetaおよびActa2の遺伝子機能およびシグナル解析を進めていくことになった。その為、当初の研究計画から若干内容が変化してきているが、歯根膜細胞における重要な因子の機能が明らかになりつつあり、本研究テーマに即した成果が得られていると考える。
また、本研究のメインテーマであるマウス歯胚を用いた歯根膜発生・形成に重要な特異的因子を同定のためのRNA-seqによる発現遺伝子の網羅的解析は、予定通り進行しているため今後、新たな因子の同定につながっていくと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、得られたRNA seq解析結果を用いて歯小嚢の高発現遺伝子群を各々検出後、パスウェイ解析やenrichment解析により歯根膜形成に重要な候補因子として関連する転写因子や細胞機能に関わる分子を抽出する。並行して、マウス臼歯歯胚より歯小嚢細胞および歯乳頭細胞を分離後、両細胞株を樹立する。各候補因子の発現について、両細胞におけるmRNAレベルでの比較検討を定量的RT-PCR法にて行い、さらに歯小嚢および歯根膜での発現について、マウス臼歯歯胚発生期組織切片を用いて経時的に免疫組織学的あるいはin situ hybridization法にて検討する。マウス歯根形成期歯胚歯胚器官培養法を用いた機能解析を行う予定である。
本研究の結果により歯根膜発生・形成に重要な特異的因子を同定し、歯根膜発生機構の一端を明らかにすることができると予測される。
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