2022 Fiscal Year Annual Research Report
Novel approach focusing on the tight junction-based paracellular barrier combined with the apical barrier toward understanding and manipulating epithelial barriers
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19H05468
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| Research Institution | Teikyo University |
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Principal Investigator |
月田 早智子 帝京大学, 先端総合研究機構, 教授 (00188517)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田村 淳 帝京大学, 医学部, 准教授 (00362525)
Danev Radostin 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 教授 (50415931)
後藤 慎平 京都大学, iPS細胞研究所, 教授 (50747219)
田中 啓雄 帝京大学, 医学部, 助教 (70795905)
中村 駿 東京医科歯科大学, 高等研究院, プロジェクト助教 (80882779)
柏原 宏香 帝京大学, 先端総合研究機構, 助教 (20966692)
足澤 悦子 大阪大学, 大学院生命機能研究科, 助教 (00446262)
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| Project Period (FY) |
2019-04-23 – 2024-03-31
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| Keywords | 上皮バリア / タイトジャンクション / クローディン / クライオ電顕トモグラフィー / アピカル膜 / 細胞骨格 / 液-液相分離（LLPS） / TJMAP |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. タイトジャンクション (TJ) -細胞間バリアの生体内での分子構築
(1)培養上皮細胞における任意のクローディンにより構築されるTJ上皮細胞の確立：クローディン(Cldn)を発現しない培養上皮細胞をもとに、任意のCldnを発現する上皮細胞系を確立し、細胞生物学的および生理学的解析を進行中である。上皮細胞では、通常複数のCldnが発現するため、個々のCldnの性質が不明瞭である点を解決し、Cldnサブタイプ特異特性の情報を獲得中である。(2)Cryo-FIBとクライオ電顕トモグラフィー ：液体窒素凍結した培養上皮細胞から得たTJを含む薄層ラメラに対してクライオ電顕を行うための最適条件設定を進めている。
2. TJ-アピカル複合体の階層縦断的な解析
2.1 細胞レベルでのTJ－アピカル複合体の機能解析：TJとアピカル骨格のインタフェースとしての微小管結合蛋白質TJMAPsについて解析を進めている。特に、TJMAP2（COBL）が液-液相分離（LLPS）を生じ、微小管依存的にアピカル骨格と細胞間バリア制御を行うこと見出し、論文として発表した（2023, Science Advances）。2.2 組織レベルでのTJ－アピカル複合体の機能解析：マウス気管上皮初代培養細胞（MTEC）において、基底小体（Basal body: BB）とそれに付随するBasal foot (BF) が各々、緑GFPと、赤mRuby3により2蛍光色ラベルされたトランスジェニックマウスを用いて、ライブイメージング像を取得し、「多繊毛上皮細胞が発生・分化する過程で、どのように繊毛根元の基底小体の方向性と配列が揃い、秩序ある繊毛運動が確立するか」について、結果をまとめ、論文の作成を進めた。2.3 個体レベルでのTJ－アピカル複合体の機能解析： Cldn15およびCldn18について、個体を含む解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. タイトジャンクション (TJ) 細胞間バリアの生体内での分子構築
1.1 培養上皮細胞における任意のクローディンによるTJ再構築細胞系の確立と比較検討：全CldnをKOした上で、単一種類の任意Cldnさらに複数種Cldnsを発現する培養上皮細胞系の樹立を完成させる。安定な細胞系列の獲得が難しい細胞種があり、Cldnの特性を反映する可能性がある。これらの細胞についてクローディンの機能的特性解析を進める。複数種Cldnの発現では、種々の制御が加わると思われ、その解析も進める。1.2 Cryo-FIBとクライオ電顕トモグラフィー ：Cryo-FIBでは、培養細胞を凍結して、収束イオンビーム(FIB)によりTJを含む薄層ラメラを作製してTJのトモグラフィーの最適条件を得る。本項は、分担研究者グループと共同で進めている。撮像数上昇問題が大きく進行を阻んできたが、TJの金粒子標識など、現状を打破できる可能性を模索する。
2. TJ-アピカル複合体の階層縦断的な解析
2.1 細胞レベルでのTJ－アピカル複合体の機能解析：TJとアピカル骨格のインタフェースとしての微小管結合蛋白質TJMAPsについて系統的解析を進める。LLPS(液-液相分離)におけるTJMAPs役割について、特にTJの視点から解析を発展させる。2.2 組織レベルでのTJ－アピカル複合体の機能解析：気管上皮初代培養(MTEC)において、基底小体（Basal body: BB）とBasal foot (BF)のGFPと赤蛍光の2色ラベルされたトランスジェニックマウスの解析結果を論文にまとめる。2.3 個体レベルでのTJ－アピカル複合体の機能解析：腎臓でのCldn15の発現が血管の機能解析を行う。また、皮膚およびその付属器におけるCldn1, 3の機能解析を進めるために、部位特異的コンディショナルを含むKOマウス解析を進める。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. タイトジャンクション (TJ) 細胞間バリアの生体内での分子構築
1.1 培養上皮細胞における任意のクローディンによるTJ再構築細胞系の確立と比較検討：全CldnをKOした上で、単一種類の任意Cldnさらに複数種Cldnsを発現する培養上皮細胞系の樹立を完成させる。安定な細胞系列の獲得が難しい細胞種があり、Cldnの特性を反映する可能性がある。これらの細胞についてクローディンの機能的特性解析を進める。複数種Cldnの発現では、種々の制御が加わると思われ、その解析も進める。1.2 Cryo-FIBとクライオ電顕トモグラフィー ：Cryo-FIBでは、培養細胞を凍結して、収束イオンビーム(FIB)によりTJを含む薄層ラメラを作製してTJのトモグラフィーの最適条件を得る。本項は、分担研究者グループと共同で進めている。撮像数上昇問題が大きく進行を阻んできたが、TJの金粒子標識など、現状を打破できる可能性を模索する。
2. TJ-アピカル複合体の階層縦断的な解析
2.1 細胞レベルでのTJ－アピカル複合体の機能解析：TJとアピカル骨格のインタフェースとしての微小管結合蛋白質TJMAPsについて系統的解析を進める。LLPS(液-液相分離)におけるTJMAPs役割について、特にTJの視点から解析を発展させる。2.2 組織レベルでのTJ－アピカル複合体の機能解析：気管上皮初代培養(MTEC)において、基底小体（Basal body: BB）とBasal foot (BF)のGFPと赤蛍光の2色ラベルされたトランスジェニックマウスの解析結果を論文にまとめる。2.3 個体レベルでのTJ－アピカル複合体の機能解析：腎臓でのCldn15の発現が血管の機能解析を行う。また、皮膚およびその付属器におけるCldn1, 3の機能解析を進めるために、部位特異的コンディショナルを含むKOマウス解析を進める。
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